Диссертация (1090326), страница 32
Текст из файла (страница 32)
К0 = k+0/k-0 является константой равновесия для кислорода, тогда как k+0 иk-0являютсяконстантамискоростипоглощенияивыделениякислорода,соответственно. Численные значения параметров Vmax = kcat[Etot] и КМО2 былиопределены на основе экспериментальных кинетических кривых.167Эксперимент к главе 7Материалы и общие методыМатериалы, использованные в работе, а так же методы клонированиямутантовr12/15-LOXКинетическиеприведеныисследования,вэкспериментальнойколичественныйанализчастикскоростиглаве5.окислениясубстратов и анализ липоксигеназных продуктов проводили по методикам, какописано в экспериментальной части к главе 6. Из-за плохой растворимостисложных эфиров органических кислот в водной среде, аликвоты, содержащиеразличные концентрации метилового эфира АК, вводили в реакцию в видеметанольного раствора, сохраняя при этом постоянный объем растворителя (30мкл).
Очистку белковых препаратов проводили с использованием системы FPLCÄKTA P-920, снабженной монитором UPC-900 (GE Healthcare, Швеция).МетодикиЭкспрессия, выделение и очистка рекомбинантных препаратов r12/15LOX и ее мутантов. Рекомбинантную r12/15-LOX кролика и ее мутанты получалиэкспрессией гибридных белков, содержащих последовательность 6-ти His в E.coliпомодифицированнойметодике.Дляэтогобактерии(XL-1Blue)трансформировали с использованием рекомбинантных плазмид. Культуру в средеLB (18 л), содержащую 100 мг/л ампициллина, инокулировали с использованиемпредварительно полученн ой культуры (600 мл) из расчета 30 мл на 1 л среды.Бактерии выращивали при 37°С в течение 20 ч, после чего экспрессиюрекомбинантного белка индуцировали прибавлением 1 мМ изопропил-1-тио--Dтиогалактопиранозида(конечнаяконцентрацияврастворе).Культурывыдерживали дополнительно еще 3 ч при 30оС, бактерии осаждали, промывали(натрий-фосфатымбуфером,суспендировали60вмлсодержащимтогоже137буфера.мМКлеткиNaCl)иповторногомогенизировалисиспользованием гомогенизатора высокого давления Emulsiflex-C5 (Avestin, Канада)при давлении в 15 МПа и твердый остаток осаждали центрифугированием (30 мин,23700 x g).
Супернатант отделяли и наносили на колонку с никель-агарозой 0,4 мл(Qiagen, Германия). Колонку промывали (4 х 2 мл) промывочным буфером (100 мМТрис-HCl, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола (рН 8,0). Белки элюировали с колонкибуфером для элюции (100 мМ Трис-HCl, 300 мМ NaCl, 200 мМ имидазола, рН 8,0)(5 х 0,6 мл). Каждую из пяти фракций проверяли спектрофотометрически налипоксигеназнуюактивность.Фракции,168проявляющиенаибольшуюферментативную активность (фракции 2-4) объединяли, разбавляли 20 мМ Tris-HClбуфером (рН 7,4) в соотношении 1:50 (по объему) и очищали на колонке с Qсефарозой объемом 500 мкл (Amersham Biosciences, Германия) с помощьюанионообменной хроматографии.
Для этого неспецифические белки сначалаотмывали 2 мл 20 мМ Tрис-HCl буфером (рН 7,4), после чего фермент элюировалираствором 120 мМ KCl в том же буфере. Фракции по 0,25 мл отбирали и проверялиспектрофотометрически на липоксигеназную активность. Фракции, содержащиеактивный белок, объединяли и подвергали обессоливанию с использованиемколонкиEcno-PackR10DGСША)(Bio-Rad,длядальнейшейочистки.Анионообменную хроматографию проводили на колонке ResourceQ 6 мл (GEHealthcare, Швеция). Объединенные фракции (8 мл) загружали на колонку иэлюировали в линейном градиенте буферов А и Б (буфер А: 20 мМ Трис-HCl (рН6,8 или 8,0); буфер Б: 20 мМ Трис, 1 М NaCl, рН 6,8 или 8,0). Фракции (1 мл),которые содержали целевой белок LOX (приложение 7), объединяли подвергалидальнейшей очистке методом гель-фильтрации на колонке SuperdexTM 200 10/300GL (GE Healthcare, Швеция).
Белки элюировали с использованием 20 мМ Трисбуфера, содержащим 200 мМ NaCl, рН 6,8 или 8,0 (приложение 8). Очищенныепрепараты LOX концентрировали до конечной концентрации от 0,5 до 3 мг/мл,используя концентраторы Spin-XR 6 30k MWCO (Corning, Великобритания).КонцентрациюLOXопределялиспектрофотометрическисиспользованиеммолекулярного коэффициента экстинкции (1,78 мг/(мл см) при 280 нм). СодержаниежелезавпрепаратахLOXизмерялиспомощьюатомно-абсорбционнойспектроскопии на приборе Perkin Elmer AA800, оснащенным автоматическимпробоотборникомAS800.Какправило,молярноесоотношениежелезакапоферменту составляло 0,60 - 0,85 для фермента дикого типа и мутантов. Чистотуполученых препаратов подтверждали с помощю электрофореза SDS-ПААГ(приложение 9).
Электрофорез SDS-ПААГ проводили по методике, описанной вэкспериментальной части к главе 5.Изоэлектрическоефокусирование.Изоэлектрическоефокусированиепроводили с использованием IEF гелей с диапазоном рН 5-8 (BioRad, Германия) имаркера Broad PI (GE Healthcare, Швеция).
Для нанесения на гель использовали0,5мкгпрепаратаосуществляласьприLOX,растворенногокомнатнойв50%температуревглицерине.следующихФокусировкаусловиях:предварительная фокусировка в течение 60 мин при постоянном напряжении 100 Ви силе тока 15 мА, затем в течение 60 мин при напряжении 250 В при напряжении169500 В в течение 30 мин при конечной силе тока в 15 мА.
Гели проявлялисеребреным окрашиванием по стандартному протоколу.Мембраное связывание.Исследования по мембранному связываниюпроводили по ранее описанной методике [77]. Для этого субмитохондриальныечастицы (200 мкг) инкубировали в присутствии рекомбинантных ферментов (3 мкг)в 50 мМ буфере HEPES, содержащем 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT, рН 7,4(общий объем 25 мкл) в течение 5 мин при комнатной температуре.
К полученнымобразцам осторожно прибавляли 100 мкл сахарозного буфера (500 мМ сахарозы вбуфере HEPES, содержащем 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT, рН 7,4) ицентрифугировали градиенте сахарозы в течение 15 мин при 100000 х g. при 4°С. Ксупернатанту, который отделяли и переносили в отдельную пробирку, проибавлялираствор альбумина (конечная концентрация 0,3 мг/мл).
Белки супернатантаосаждали с помощью трихлоруксусной кислоты, осадок центрифугировали втечение 20 мин при 20000 х g. Супернатант стадии центрифугирования удаляли итвердые остатки ресуспендировали в 5 мкл концентрированного загрузочногобуфера для электрофореза (Roti-Load, Германия). После прибавления 15 мкл водыобразцы нагревали до 95°С в течение 5 мин и подвергали эдлектрофорезу вденатурирующих условиях (SDS-ПААГ). После электрофореза белки подвергалиВестерн-блоттингу с использованием нитроцеллюлозной мембраны и антител(анти-RGS-His (Qiagen, Германия) и конъюгатов IgG антител мыши с пероксидазой(Sigma, Германия). Визуализацию осуществляли с помощью реагента WesternLightning Chemiluminescence Plus (PerkinElmer Life Sciences, США).Термодинамические расчеты.Длясозданиямолекулярных моделей,использованных при анализе результатов малоуглового рентгеновского рассеяния(МРР) были созданы модели димеров на основе данных кристаллическойструктуры и проведен теоретический анализ их устойчивости.
Термодинамическуюстабильность димеров оценивали с помощью программ (PSAIA) [306] и PISA [253].Спектроскопия кругового дихроизма (КД) и флуоресценции. Денатурациюбелка контролировали путем измерения сигнала КД при 220 нм с использованием0,1 см кварцевой кюветы и спектрополяриметра Jasco-710 при различныхтемпературах.Содержаниеальфа-спиралнойибета-складчатойструктуроценивалось с помощью пакета программного обеспечения Jasco.
Динамическиеизмерения флуоресценции проводили на спектрофлуориметре K2 (ISS, Champaign,США), оснащенным поляризатором Глана-Томпсона, с помощью техники фазовогосдвигаидемодуляции.Вовсех170измеренияхпостояннаятемператураподдерживалась с помощью внешнего термостата. В качестве источника светаиспользовали лазерный диод с длиной волны эмиссии при 300±6 нм длянаблюденияфлуоресценциитриптофанов.Эмиссиюфлуоресценциирегистрировали с использованием фильтров (WG 320 или WG 330). Измерения приповышенном давлении выполнялись на аналогичном приборе, оснащеннымячейкой высокого давления ISS [307]. Диапазон давления не превышал величины в2500 бар из-за ограничений по устойчивости материала измерительной кюветы.Анализ переходов, индуцированных давлением, проводили на основе модели,предусматривающейналичиетрехпереходныхсостояний,вкоторойпредполагалось, что каждая константа равновесия (K1, K2) экспоненциальнозависит от различий в объеме гидратации, в соответствии с уравнением:Динамическое рассеяние света.
Измерения проводили на приборе Horiba(Киото, Япония) LB-500, снабженным лазерным диодом (650 нм, 5 мВт). Анализданных проводили с помощью прилагаемого программного обеспечения сиспользованием метода преобразования Фурье.Денатурация белка под действием GdnHCl. Аликвоты, содержащиеразличные концентрации GdnHCl, были приготовлены на основе стоковогораствора GdnHCl (8 М) в 20 мМ Трис-буфере (рН 8,0). Белок инкубировали вприсутствии GdnHCl (различные концентрации) в течение 12 ч при 4 oС и степеньденатурации измеряли с помощью методов кругового дихроизма и флуоресценции.Каждое измерение повторяли не менее трех раз.
Обратимость процесса проверялиразбавлением полностью денатурированного образца с помощью буфера. Дляописания экспериментальных данных денатурации белка под действием GdnHClиспользовли трехступенчатую модель, в которой промежуточные фракции белканаходится в равновесии с нативной и полностью денатурированной фракциейr12/15-LOX:KK12N I U(1)где константы равновесия K1 и K2 связаны со значениями свободной энергии G1 иG2 в соответствии с уравнением 2 [308]:171K i eGiRT(2)иGi Gi, H 2O mi D(3)Значения Ki рассчитывается для каждой концентрации GdnHCl исходя изсоотношений:K1=FI/FN иK2=FU/FI,где доли исходной (FN), частично (FI), и полностью (FU) денатурированнойлипоксигеназыполученынепосредственнонаосновеанализаданныхфлуоресценции и КД [309].
В частности, величина сигнала Y (либо максимум встационарном спектре флуоресценции или интенсивность КД-спектра при 220 нм)была затем пересчитаны в виде линейной комбинации индивидуального вкладакаждой компоненты:Y=FNYN+FIYI+FUYU(4)Оценку основных параметров модели, характеризующих переходные состояния(таблица 11), проводили с использованием метода наименьших квадратов вусловиях нелинейной регрессии.Малоугловоерентгеновскокоерассеяние(МРР).ИзмеренияМРРпроводили в Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL), используяпучок X33 накопительного кольца DORIS (немецкий синхротрон, Гамбург) [310], придлине волны рентгеновского излучения 1,54 Å и расстоянии между образом идетектором 2,7 м. Детектор типа PILATUS использовали для записи четырехпоследовательных кадров продолжительностью в 30 с, которые усредняли послеподтверждения отсутствия радиационного повреждения.
Для облегчения загрузкиобразцов и очистки измерительной ячейки использовали автоматическую систему[311]. Контрольные измерения соответствующих буферных растворов проводилидо и после измерений целевого образца белка, вычитая усредненные значения,полученные для буфера, из экспериментальных данных, полученных для172препаратов фермента. Раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА, 4,6 мг/млв 50 мМ HEPES, рН 7,5) использовали для калибровки молекулярной массы. Дляанализа были использованы образцы фермента, в которых не наблюдалосьнеспецифической агрегации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
