Диссертация (1090326), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Начальные скорости вуравнениях (10) приведены к нулю (Р) = (О2•) = 0.Расчет начальных скоростей. Прогрессивные кривые, полученные методомоксиграфических измерений, были сглажены путем усреднения для уменьшениясоотношения шума к сигналау при расчете первых производных скорости реакции.Для каждой точки кривой, значение переменной рассчитывали как среднееарифметическое значение данных 10 предшествующих и 10 последующих точек.Начальные скорости реакции рассчитывали по наклону начального участкаспектрофотометрических кривых, в условиях, когда суицидальная инактивацияфермента минимальна. Оценку основных параметров модели проводили сиспользованием метода наименьших квадратов в условиях линейной регрессии.Статистическая оценка. Качественную оценку кинетической модели поотношению к экспериментальным данным определяли на основании фактора B:B 1SLSVAR163гдеSLSпредставляетсобойрасхождениемеждутеоретическимииэкспериментальными данными, и VAR – дисперсию экспериментальных данных.Величина В представляет собой процент вариаций, которые могут быть объясненыс помощью модели по сравнению с общей вариабельностью модели.
Как правило,кинетическая модель адекватно описывает экспериментальные данные привеличине B > 0,5.Методики к разделу 6.3Структурное моделирование комплекса r12/15-LOX-субстрат. Используяпакет программного обеспечения VMD [297], на основе рентгеновских координатr12/15-LOX кролика [31] была создана сольватированная (физиологическиеконцентрации соли)структурнаямоделькомплекса r12/15-LOX с АК.АКрасположена в субстрат-связывающем кармане фермента таким образом, что ееметильный конец находится в непосредственной близости от детерминантпозиционнойспецифичности[32].Карбоксильнаягруппажирнойкислотырасположена на расстоянии связывания от остатка Arg403 [32], про-S атом водородаположении С-13 молекулы АК расположен в непосредственной близости отгидроксид анионов комплекса железа [246].
В силу того, что r12/15-LOX кроликасохраняет свою каталитическую функциональность без N-концевого домена [77], Nтерминальный домен (аминокислотные остатки 1-111) был исключен из системыдля уменьшения времени расчетов. К моменту начала выполнения данной работы,кристаллографические данные [31] представляли собой неполную структуру r12/15LOX кролика, в которой рентгеновские координаны ряда атомов в молекулеферментанебылиопределены.Такимпроблемнымрегиономявляетсяпоследовательность между а.о. 177-188. Для завершения структуры белка былсмоделирован сегмент длиной в 18 аминокислот.
В силу низкого сродствааминокислотной последовательности в этом регионе фермента сравнительныйанализ структур фермета кролика со структурой фермента сои [46] не принесположительных результатов. Тем неменее, использование различных методовустановленияструктуры[299–301]указывалонаспиральнуюструктурунедостающих остатков, что позволило создать модель этой области в видестандартной спирали с известной последовательностью. В кристаллическойструктуре, негемовое железо Fe(II) координируется 4-мя остатками гистидина икарбоксильным атомом кислорода С-концевого изолейцина.
Шестая позицияостается вакантной. Напротив, в структуре комплекса фермент-ингибитор, шестойлиганд в координационном комплексе Fe(III) представляет собой гидроксид анион,164который может являться акцептором протона во время его отщепления отмолекулы арахидоновой кислоты. Для создания комплекса r12/15-LOX-ПНЖК,ингибитор удаляли из системы и АК помещали в субстрат-связывающий карман(приложение 5).
Поиск и заполнение внутренних сайтов гидратации былосуществлен с помощью программы Dowser [302]. Гидратированную системубелок-субстрат сольватировли водой, содержащей ионы хлорида натрия вфизиологической концентрации. Количество ионов (Cl- и Na+) выбиралось такимобразом, чтобы нейтрализовать суммарный заряд элементарной ячейки в процессепроведения расчетов. Полная модель содержала примерно 44400 атомов.Определениепараметровсиловогополякомплексаr12/15-LOXсарахидоновой кислотой. Для белка, воды и ионов были использованы параметрысилового поля CHARMM [303].
Не достающие параметры комплекса железа вr12/15-LOXопределялиспомощьюкомпьютернойпрограммыPARATOOL(PARATOOL–расширенная версия программы VMD, которая распространяется сверсией VMD-1.8.5). Для параметризации модели каталитического центра (Fe(III))использовались четыре кольца имидазола, представляющие гистидин, остатокуксуснойкислоты,представляющийС-концевойизолейцин,иОН−группа.Молекулярную геометрию модели оптимизировали с использованием DFT сфункцией Becke3LYP на 6-31+G* основе [304]. Все неэмпирические расчетыпроводились с помощью пакета программного обеспечения Gaussian 03 [305] какописано ранее [251].Идентификацияэнергитическихбарьеровсиспользованиемкартсвободной энергии.
Метод неявного лиганда лиганда позволяет создать картысвободной энергии Гиббса путем помещения одной молекулуы в определенномэлементе объема (воксела) в 3D-пространстве. Для определения маршрутовдиффузии кислорода с поверхности белковой матрицы в активный центр, былразработан алгоритм, позволяющий найти пути с минимальной энергией. Этодостигается путем постепенного затопления «энергетического ландшафта» исходяиз глобального минимума. Начиная с объемного элемента с самой низкойэнергией, были найдены все соседние элементы с уровнем энергии, находящимсяна более низком уровне, чем текущий (приложение 6).Симулирование молекулярной динамики. Для ансамблей NPT все расчетыбыли проведены в условиях постоянного давления и температуры; для ансамблейNVT с фиксированными атомами – в условиях постоянного объема и температуры.При моделировании использовались неортогональные периодические граничные165условия с гексагональной геометрией элементарной ячейки (a=78Å, b=72 Å, c=102Å, =56,6o).
Размер элементарной ячейки обеспечивал минимальное расстояние в15 Ǻ между соседними атомами белка в решетке. После завершения основногоструктурногомоделированияфермент-субстратногокомплекса(достройкафермент-субстратного комплекса), его структуру оптимизировали сведениемэнергии к минимуму и уравновешивали в течение 50 пс.
Pro-S атом водорода вположении С13 молекулы АК фиксировали на расстоянии 2,3 Å от OH-лигандаFe(III). Структура смоделированной спирали удерживалась под действием внешнейсилы в 100 пН во время фазы инициализации для предотвращения ее разрушения.Систему уравновешивали в течении 1,1 нс без каких-либо ограничений.Моделирование проводили с помощью двух независимых методов. Одну молекулумолекулярного кислорода помещали внутри субстрат-связывающего кармана внепосредственной близости от места его введения в структуру АК (С15).
Другуюмолекулу кислорода помещали вблизи боковых цепей остатков His426, Val427 иLys146, области, гомологичной внутренней части канала для транспорта кислородасоевой LOX-1 [93]. Диффузию кислорода контролировали в течение 2 нс дляфермента дикого типа и его мутантов. При моделировании диффузии кислородаиспользовали метод неявного лиганда [250]. На начальном этапе системууравновешивали в отсутствии кислорода. Затем молекулы кислорода помещали всистему и вычисляли свободную энергию, которая показывает вероятность егонахождения в определенных обьемных элементах системы.
Для создания картысвободной энергии r12/15-LOX дикого типа и ее мутантов било использовано более8000 различных конформаций белка с 4-нс траекторией. Каждый элемент объемасвободной энергии на карте имел объем 1A3.Кинетические измерения и количественная оценка сродства фермента ккислороду. Кинетические исследования в условия нелимитирующих концентрацийПНЖК (условия псевдо-первого порядка) и анализ липоксигеназных продуктовпроводили, как описано в методиках к разделу 6.1.
Количественный анализкинетических данных была основана на схеме реакции:(1)где ES* представляет собой радикальный комплекс фермент-ПНЖК и ES*О2 –комплекс фермент-ПНЖК с кислородом [241]. Уравнение скорости реакциивыражается следующим уравнением:166(2)где [Etot] представляет собой общую концентрацию фермента. Константа скоростикатализа совпадает с константой скорости отщепления атома водорода, т.е. kcat=kS.Соотношение между kcat и соответствующей константы Михаэлиса для кислородаможно представить в виде:(3)где kр обозначает константу скорости введения кислорода в радикал жирнойкислоты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
