Диссертация (1090326), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Измерения проводили при номинальном разрешениив 30 Å. Обработка и анализ данных проводились с использованием программыPRIMUS [280]. Для анализа полидисперсных образцов использовалась улучшеннаяверсияпрограммыSASREF[278],позволяющаяодновременныйучетполидисперсности системы и пространственную подвижность жестких структурныхэлементов молекулы фермента. Радиус вращения фермента дикого типарассчитывали на основе кристаллической структуры (2P0M) с помощью программыCRYSOL [312]. Для анализа и оценки доли объемных фракций компонентов смеси,кривые МРР были представлены в виде линейной комбинации теоретическогопрофиля, вычисленного на основе кристаллической структуры r12/15-LOX имоделейсоответствующихкомпонентовраствораспомощьюпрограммыOLIGOMER [280].
Структура конформера A, содержащего 2 домена (A:2-108|A:109663), была использована для создания модели димера (A:2-108|A:109-663, A109663|A:2-108) на основе P2 симметрии. Каталитические домены (109-663) былизакреплены по отношению друг к другу для сохранения интерфейса, тогда как Nконцевые домены (2-108) могли свободно перемещаться. Модель тетраметраL183E+L192E в присутствии лиганда была построена в P222 симметрии сиспользованием программы SASREF [278].
Анализ и оценку доли объемныхфракций мутанта в отсутствии лиганда проводили с помощью программыOLIGOMER [280].Молекулярная динамика фермент-субстратного комплекса. Димерныемодели (конформер A и Б), в которых АК связана с конформером Б r12/15-LOX,были построены для фермента дикого типа и двойных мутантов W181E+H585E иL183E+L192E на основе кристаллографической структуры r12/15-LOX (PDB 2P0M).Кофактор (Fe(III)-OH) был встроен в молекулы каждого из мономеров с учетомоктаэдрической координационной сферы железа.
АК помещали в активный центриспользуя ранее полученные координаты для конформера Б [119]. Недостающиеатомы водорода были встроены, используя приложение HBUILD силового поляCHARMM (версия c35) [313]. Создание двух двойных мутантов (W181E+H585E иL183E+L192E) проводили заменой боковой цепи остатков по месту мутации вмодели фермента дикого типа с последующей оптимизацией их конформаций(программа Chimera версии 1.5.2 [314]). Для подтверждения стабильностиинтерфейса и сравнения мутантов с ферментом дикого типа каждую из моделей173исследовалиметодомимолекулярнойдинамики.Полученныекомплексысольватировали в элементе объема 151 Å x 121 Å x 73 Å.
Суммарный зарядсистемынейтрализовалидобавлениемкатионовнатрия.Полученныесольватированные димерные системы представляли собой ~ 141713 атомов, изкоторых~41497атомоввходиливсостав1326аминокислотдимера.Моделирование проводили при постоянном давлении и температуре (CPT) сиспользованиемпериодическихграничныхусловий.Примоделированиииспользовали систему постоянного давления и алгоритм постоянной температурыГувера [315]. PBC встраивали с помощью модуля CRYSTAL силового поляCHARMM, используя орторомбическую ячейку.
Шаг по времени в 2 фс (алгоритмSHAKE) использовали для всех углов и связей с участием атомов водорода [316].Все представленные системы сначала оптимизировали сведением их к энергии кминимуму, а затем доводили до расчетной температуры (300 K). Для каждогодимера проводили две независимые, отличающиеся по скорости симуляции,продолжительностью 4 нс.
Для атомов белка моделирование проводили впараметрах силового поля CHARMM-22 [298, 317]. Для атома железа и его первойкоординационной сферы использовались ранее оптимизированные параметры[251]. Топология силового поля и параметры липидного субстрата были полученына основе CHARMM-27 [318].174ПРИЛОЖЕНИЯПРИЛОЖЕНИЕ 1.1 mgvyrvcvst gasiyagskn kvelwlvgqh gevelgsclr ptrnkeeefk vnvskylgsl61 lfvrlrkkhf lkedawfcnw isvqalgaae dkywfpcyrw vvgdgvqslp vgigcttvgd121 pqglfqkhre qeleerrkly qwgswkegli lnvagskltd lpvderfled kkidfeasla181 wglaelalkd slnvlapwkt lddfnrifwc grsklarrvr dswqedslfg yqflnganpm241 llrrsvqlpa rlvfppgmee lqaqlekelk agtlfeadfa lldnikanvi lycqqylaap301 lvmlklqpdg klmpmviqlh lpkigssppp lflptdppmv wllakcwvrs sdfqvhelns361 hllrghlmae vftvatmrcl psihpvfkli vphlrytlei nvrarnglvs dfgifdqims421 tgggghvqll qqagafltyr sfcppddlad rgllgvessf yaqdalrlwe iisryvqgim481 glyyktdeav rddlelqswc reiteiglqg aqkqgfptsl qsvaqachfv tmciftctgq541 hssihlgqld wftwvpnapc tmrlpppttk datletvmat lpnlhqsslq msivwqlgrd601 qpimvplgqh qeeyfsgpep ravlekfree laimdkeiev rnekldipye ylrpsivens661 vaiАминокислотная последовательность r12/15-LOX кролика175ПРИЛОЖЕНИЕ 2.1 gaattccacg gaaacactgg cgtctaatcg ggacgcagaa ggctgagcgg acgtttcctg61 gagggagttc tatggacagg cagcaccgcg ggttctgggg aatgcgggtc tccagcccgg121 ggtggagggg tgcggtggga cacggagcct ggggcagaac gggggcagat tcttccttct181 tgccgggttt ctgccccaat cctcatttac tctccgtcgc accctcctcc caccaaagca241 acggtttgca cgccctgttc ccgcctttcg gggtcggggc tgagctcgga gctgcgggga301 gctgcgggcc cctcgcgagg ctaggcgggg ttagttggag acgagccatc cacacccaga361 cccggcccca ggcgtccggc ggggcgggcc ctggggctct gtatttagcg cggcccctcg421 tcttcgccct cacaaggcgt gcaacgaccc tgggcaagat gggtgtctat cgcgtctgcg481 tgtccaccgg ggcctcgatc tacgcgggct ccaaaaacaa agtggagctg tggctggttg541 gccagcacgg agaggtggag ctcgggtcgt gcctgcggcc cacacggaac aaggtgagcc601 gtcaggacgc gggcgcgacg gggctgagtc ttgggttcgt ccaggtcgga ggaagacacc661 accctctgcg cctcgccggc cgcgggaaga gcgcgcgtcg ggaatggggg ccggtgggca721 ctagggcagg ctccgtccac atcccgggct cccggcttcc tggcaataga ggggacaccc781 ctgcgccccc cccccccatt ccgcatcctc tggtcttgaa gcagcggcca tccgagtggc841 cgtcgggcct ccctggattt tgctttattt atttatttta caacggttac tccaaacctc901 ctcttcctgt gccggatctc cgaccctttg ggtgcagcac ccgcggggtg ggtgggggtg961 ggcggggaaa aggtgtcggg gagaaggcag ggtctgggag cgctctctct tccctcccag1021 ttcccgtcgc ctgcgacagc tccctcccct gtccctggag tccagatgtc cgttccaccg1081 cggacagtgc agtggaaccg tggtccacgg aggtccttcc ccgaactcgc gcctccccac1141 ctctctccgc ggtctaagca agactggagc gcagtcaatt ctgcctcttg ggcaacccgg1201 gcatccgtgc cctgatgttc cccccactgt ggaccaccag tggcccctgc gttctgtgtc1261 ccccgcaccc tcttagctgg tccctctgtg ccagaccgtc agagtccttc tgaaaccaga1321 acgaccccca cacccccaac acgcacaccc cagtacctgt cccggcggaa gaggctcagc1381 ctggcggaca agggcaggag cgcgccccga gcaggtggcc tcaagacccc attccaggaa1441 gccggcgcca cgtcctggca gttggtcaac ggaggcgaat tcgtccgggg agacccccca1501 gggctgcggg cgcacggggc tccacctgac ctggggccag gcctctgggg gggcattcag1561 tctcagaggg gtcgtgcagg tgcactgggc ttagctaggg agggtgagag ggacgggcgg1621 cggacaggcg agccaccctg gggaactggt gtgagcagag ggaggggaag acgtgtgccg1681 cggtggagct gggggcaccg ggtcgtgagg gtctcggagg tccagccaga gctttagatt1741 ggtctttaga ttgagcctct tctgccgctt gcaggaggag gaattcaagg tgaacgtttc1801 caagtacctg ggatcgctgc tgttcgtgag actgcgcaaa aaacactttc tcaaggaaga1861 cgcctggttc tgcaactgga tctccgtgca ggccctcggg gccgctgagg acaagtactg1921 gttcccgtgc taccgctggg tggtgggcga cggcgtccag agcttgccag tgggcactgg1981 tgagcgcggg attgggggtg cgaggagggc tccggggcac gggagagggg cctgcgtgtg1762041 aggagagggt gcagagcggg cgtgaggggt gggtgaggct ggacccggga gtcagggcgt2101 ctgggggggg gggttgtcag cgaggagggt tgctggagct gatagagggt gctgtgcagg2161 ctgggacccg ctgaggatgc gcgctgggcg gggcgcgggg cgtggcttct aggaagctcc2221 ttacttctag gctgcaccac ggtcggggat ccgcagggcc tgttccagaa acacagagag2281 caggagctgg aagagagaag gaagctgtac cagtgagccc ccctgcccct cccccactgg2341 agctgctgag caagggcgtc tgggggcctg atcttacttc tgtcccacag gtgggggagc2401 tggaaggagg ggttaatcct gaacgtggcg gggtccaagt taactgacct ccctgtggat2461 gagcgatttc tggaggacaa gaaaatcgac ttcgaggctt cgctggcctg ggggtgagag2521 ccaggggcag ggtgggggga agtcgtggat tgcccctggc tgcacgcagg tcggtggcga2581 cggcggttgt aacgttggat tctcccctga aggctggcag agctcgcttt gaagaactcg2641 ctcaatattc tggctccctg gaaaactctc gatgacttca ataggatttt ctggtgcggg2701 cggagcaagc tggcgagtca gtcctgaaaa cttggcccgg gacccctgcc ccccagatgg2761 agagaacccg gggggtgggg gtgggagagc agaggcttgg gtccctctgg tcggctgggg2821 tcaagtggga atggctcggt gggggctggg aggagctcag gaccctcagg gagctcaaca2881 agtgccatcc ccagggcggg tgcgggactc ctggcaggag gactccttgt tcgggtacca2941 gtttctcaat ggcgccaacc ccatgctgct gaggcgctct gtccagcttc ctgcccgcct3001 ggtgttccct ccgggcatgg aggagctgca ggcccagctg gagaaggagc tcaaggtatg3061 gacgtcagag ccctgagggg gcgtggccag tggtcgtgtg ggcgggaagg ctgtagcagc3121 cttatgggtc tggcttgctg cagctcagca agagggggtt ctcaagagaa ctcccggaca3181 gtgtattgtg gagggcaggt gagcaaggtg ggatggttga tggagacaga ataacaatga3241 agaaatgcag cttgggcgga ggggggctga agagtaagag tcggggggtg gtggtcaggg3301 ggtagggctg tgagtcagga gctaacagtg gaaccactga gagagaaagt tcaccccggg3361 acacgggttt gaatcctggc cctgctctct gtaaggcgtg agagctcggg caggttctca3421 gcctctctga tcagccgctc cccctcctgg aacgctgggg cactctcagg tagagtgggt3481 gggcacgatg ggcagtgaga agcaccgggt ccagcacccg gcacaaagtg gtgctgggga3541 caagttagtt ctcttcttcc tcgggggtgg aggggtggcg aggagacggc gggtgtgcga3601 cggccgtcct gtgctctctg catgcaggca ggcacgctgt ttgaagccga cttcgccctg3661 ctggataaca tcaaggccaa cgtcatcctg tattgccagc agtacctggc tgccccgctg3721 gtcatgttga aactgcagcc cgatgggaaa ctcatgccta tggtcatcca ggtgtgggca3781 cccaagattt ctcgtccccg gtgtgtggcc ttctcggctc agccaccatc aggcctcagt3841 ggttccctgg gaacgcactc tcaggctaag gcctggctgg ggcgcatgtt gcagggatga3901 attgcccaag tgggtcggag gcgtgtggat ggagaggaaa gatggtggga aagacaaaga3961 gcgaggaaga ggcagattca gccggcctgg attcaggcag agaggtacag ggggtggggg4021 gtcagccagg cacctgcagc agtgggacaa accaagaggt atggggaggg agggtcagcc4081 aggcaccttc agcagtggga caaaccaaga ggtacagggg gtggggaggt cagccaggca4141 cctgcagcag tgggacaaac caagaggtac agggggtggg aggtcagcca ggcacctgca4201 gcagtgggac aaaccaagag gtacaggggg tggggggtca gccaggcacc tgcagcagtg1774261 ggacaaacca agaggtacag ggggtggggg gtcagccagg cacctgcagc agtgggacaa4321 accaagaggt acagggggtg gggggtcagc caggcacctg cagcagtggg acaaaccaag4381 aggtacaggg ggtggggggt cagccaggca cctgcagcag tgggacaaac caagaggaag4441 agctgcttgg gtaggctctt gtcgctccta tttcgggatc atgggggagg catttgggtg4501 gtctggcagg caaccaagca ctgtaggctt agtcatttgc ctagaggtgg tgttgaaaga4561 ggggagagag atctagatct ctcaacaaga gtgtgggctg aaggaagcag ggggtttgaa4621 tcttgtcctc tctgcgggga cagaaagagg aggtgcaggc agggagacat ggtacctgca4681 gagggcccag ggcagagcag gttgccgtgt taatgtctca agagggtggg agaaggaggg4741 gatggagaaa tcgaagtaaa cttggaggag gaagggtgag gttaaacatt caaaggacca4801 aggattgttg ggcacctggt gctcatccct tcccttcccc cctccctgcc ttgtccctgt4861 cccagctcca tttgccaaaa atcggatcct ccccaccacc gcttttcctg cccacggacc4921 cccccatggt ctggctgctg gccaaatgct gggtccgtag ctctgacttc caggttcatg4981 agctgaattc tcatcttctg aggggacact tgatggccga ggtcttcacg gtggccacca5041 tgagatgtct tccatccata catcctgtct tcaaggtaac acctgaggct tcctctgtgg5101 gccttagggt aaggggagaa ccagccaagg aagacaagag agcaaaggag tgagggccta5161 agcttgcatg tcattttcag tgagtggtat cacctctcaa ggggggcagg aatgattctt5221 gggaaaaggg gtgaaaaaag gtttgcataa agcatgaata ttcttatagt acttagacaa5281 catgcaaatg atggaagatt ctatccaatc agaggagacc atgcaaataa tgtaaaaact5341 attttcaggc agtcttttca gagttctaaa agagcataca ggctagttag agggggactc5401 aggcccacag cagcaggctg gtgtacatag acaattagag caaagtgttc acctactgaa5461 cactctcact gggtgtctcc tgtgtggcaa gaaccactgt agacaactgt aggttaggca5521 aagtccctat cttgcgggat gtccgttttc agtaaggtga cgctaaagat tgtattgtca5581 caagccagct gtgacaagtt tggtgcaagg aattaaagcg tgttggtgtg agggtgagtt5641 tagatcggtc aggaacaggc tgccttggag agacggcggg gagatgagct ctccaccctg5701 gatgggcaga aggaggtggc cgtggtggcg tggtggcgcg ggacgggtgg ggagctgaag5761 ttctggaggt gggctgggcg tgctcagtgt gattagacca cctgttctca gcggagggag5821 ccccagcttc tgctgagtac tgggcgcctt ccctgcggct ccagcgccct tcccctgctg5881 tgcccgctct aaagctgatc gtcccccacc tgcgatacac cttggagatc aacgtccgcg5941 ccaggaacgg gctggtctct gacttcggca tttttgacca ggtatgggag aggatgggcc6001 tctggggctg cctctgcctc ctggctccat tgcctgactc tggccaccct tgctccccca6061 gataatgagc acgggcggcg gcggccacgt gcagctgctc cagcaagctg gagccttctt6121 aacctatcgc tccttctgtc cccctgacga tctggccgac cggggcctgc tgggagtcga6181 gtcttccttc tacgctcagg acgcgctgcg gctctgggaa atcatctccc ggtgagggga6241 gcgaggggcg gggaacagga agccccactg agcggagccc cagtggcttc agctcttggg6301 cccgcacccc tccccgcagc tacgtgcagg gaatcatggg cctctactac aaaaccgacg6361 aggctgtgag ggacgacctg gagctgcaga gctggtgccg agagatcact gaaatcgggc6421 tgcaaggggc ccagaagcaa ggtaggcgga cgtcctggcc cgaggtccca gactcaggga1786481 acaagagacc accccagaat cctctccagc tctgtggact cttttttttt ttttttttaa6541 ggtttattta ttttatttga aagagttaca gagaggcaga ggaagagagg ggagagggag6601 agggagagag agggagatct tccatctgct ggttccctcc ccaaatggcc cgcaacaagc6661 caggagctcc atccaagtct cccacatagt tcagaagccc aagcacttgg gccatcttct6721 ggtgcttttc caggccacag agagagctgg atgggaagtg gagcagccgg ggactcgaac6781 cggcgcccat ttgggatggc ggctttaccc gctacaccac agagccaccc tctatgggct6841 gttcagaagc attccccctg acagtaggac cactgggcgc tcataagtgt ttacccagtg6901 cccgtccaga gccagagccc tgacttggag catttgtcca tttgcatggt gtcaatagtc6961 ccactgcagc tacccgggtg atgtcagtca gcctgcgaca cctgggaagc cgacctcatt7021 aactcgtgtg agccaatagg agccagcacc agcgccccac cggcggaccc tcctagctca7081 gctccctcct ccccgcccgt gcccccatcc catgtcaatt cccgcaagag ttaactcacc7141 gttcccagcc ccctccccca gctctgccct tgctcctgcc tcacagctct gatttctcaa7201 tcctcgcagg gttccccacc tctttacagt ccgtggccca ggcttgccac tttgtcacca7261 tgtgcatctt cacctgcacg ggccagcact cctccatcca cctgggccag gtactatcca7321 gaggggctgg gcagctgcag ccctcgggcc ttggagacag ggaggggtcg tgtcagcaga7381 ccttgattct gagccctgtc tctccttagt tggactggtt cacgtgggtc cctaacgcgc7441 cctgcaccat gcggctgccc ccgccgacca ccaaggacgc gacgctggag acggtgatgg7501 ccacactgcc caacttgcat cagtcttctc tccagatgtc catcgtctgg cagctaggca7561 gggaccagcc cattatggtg agagccggtg ccaggagccc tgagaaatcc ggccagcggg7621 ggagaggcga ctgcagcaca gactcccccg gctctgagcc ggctttgctc tctgtgccag7681 gtgcctttgg gccagcacca ggaggagtac ttctcgggcc ctgagcccag ggctgtgctg7741 gagaagttca gggaggaact ggccatcatg gataaggaaa ttgaggtccg gaatgaaaag7801 ctggacatac cctatgagta cctgcgcccc agcattgtgg agaacagtgt ggccatttga7861 gctgcctgcc ctggctgcct cagccccctc acccttgtag ttgctggccc accctctccc7921 ccaagccctg ccctcttccc caagccctgc ccctttcccc aagccccatc ctctttcccc7981 aagccccgcc ctcttcccca agccccgccc tcttccccaa gccccaccct cttccccaag8041 ccccgccctc tttcccccac gccccaccct ctttccccaa gccccgccct cttcccaaag8101 cgctgactaa cgggtcatct tttttgtctg tgcccctggt gagcgcagag tactcagaat8161 aatgtgtgat cgctccctca gccttctcct ttgcaatttc cctccctccc tcgcttcttc8221 ctgcatcttt caggcctccc agatagccag tagtagccac attgattcca gcaattgtca8281 ggatggaatc aggtgacagt agctcgctct gcacatttgt gaatcagctg tgatttttga8341 accaaaattg agtttaacaa caaccaagag gtattttaga ctaatggtga aaaacgaact8401 tagacccaag tagcttaaat aaaatgttgg caaaagatct agaСтруктура ДНК r12/15-LOX кролика.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
