Диссертация (1151541), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Поэтому в группе 2 в которой кукурузу заменяли на62пшеницу, показатели переваримости и использования питательных веществбыли хуже (табл.9).Таблица 9. – Переваримость и использование питательных веществ кормабройлерами, % (опыт 1)ПоказательГруппа1к2о3оПереваримость: органического вещества73,768,672,8протеина94,592,593,9жира76,471,975,5клетчатки8,02,612,9БЭВ84,278,784,0Использование: азота59,355,058,4Из данных, представленных в таблице, следует, что в группе 2 переваримость питательных веществ по сравнению с контрольной группой была ниже:органического вещества – на 5,1%, протеина – на 2,0%, жира – на 4,5%, клетчатки – на 5,4%, БЭВ – на 5,5%. Азот корма использовался хуже на 4,3%.Обогащение комбикорма, содержащего пшеницу (группа 2), ферментативным пробиотиком (группа 3) оказало влияние на улучшение переваримости (%) органического вещества корма на 4,2%; протеина – на 1,4%; жира – на3,6%; клетчатки – на 10,6%; БЭВ – на 5,3%, а также использование азота – на3,4%.Полученные результаты оказались практически на уровне контрольнойгруппы, получавшей кукурузу в составе комбикорма (рис.3.).Рис.3 Переваримость и использование питательных веществ кормабройлерами, % (опыт 1)63Согласно данным повышенный уровень НПС в ксоставе комбикормаоказывает влияние на состояние микрофлоры ЖКИ птицы (Choct, M,1997).Поэтому необходимо исследовать кормосмесь по содержанию органическоговещества, использованию азота, жира, клетчатки, но самое главное – энергетическая оценка сырья, большое значение придается содержанию сырого протеина и особенно – сырого крахмала.
Поэтому зерно, применяемое в качествесырья, нужно регулярно исследовать по этим основным показателям.Поэтому, следующим этапом наших исследований стал анализ микрофлоры путем NGS – секвенирования. Результаты проведенного обследованияприведены ниже в табл. 10.Таблица 10.
–Результаты анализа микрофлоры методом NGS-секвенирования(опыт 1)Группа1-контрольная2-опытная231Полезная микрофлораБациллы00,1 ± 0,1Лактобациллы3,2 ± 1,02,3 ± 2,00,4 ± 0,4Бифидобактерии0 ± 0,01Вейлионеллы00Целлюлозолитики, в т.ч.78,4 ± 2,481,0 ± 3,1лахноспиры1,8 ± 0,11,2 ± 0,2руминококки24,4 ± 2,039,4 ± 5,9клостридии26,7 ± 5,020,9 ± 2,0бактероиды25,3 ± 4,719,3 ± 0,5эубактерии0,2 ± 0,10,2 ± 0,1Условно-патогенные бактерииЭнтеробактерии0,4 ± 0,40,2 ± 0,1Актиномицеты0,6 ± 0,30,6 ± 0,5Патогенные бактерииФузобактерии00Листерии00Стафилококки00Кампилобактер00Патогенные клостидии00Пастереллы00Пептококки00Транзитные бактерииПсевдомонады00Другие бактерииПоказатель3-опытная40,9 ± 1,64,1 ± 1,00,2 ± 0,2074,2 ± 10,01,0 ± 0,831,7 ± 6,522,2 ± 3,019,2 ± 5,00,1 ± 0,011,3± 0,90,8 ± 0,6000,3 ± 0,50,1 ± 0,10000,4 ± 0,7641ВиррукомикробиаПротеобактерииТенерикутыЭрипсипелотрихи23002,0 ± 0,11,2 ± 0,700,2 ± 0,30,5 ± 0,30,3 ± 0,2Некультивируемые бактерии14,8 ± 1,713,8 ± 1,540 ± 0,13,2 ± 0,70,3 ± 0,20,4 ± 0,313,5 ± 6,6При помощи данного исследования были получены достаточно интересные сведения.
Так птица, получавшая корм с пробиотиком, имела микрофлору, обогащенную бациллами, в 9 раз больше, лактобацилами на – 78,2%,энтеробактериями на – 650%, актиномицетами на - 33% больше чем бройлеры,которые получали тот же корм, но без Целлобактерина-Т. В ходе проведенияэксперимента при помощи NGS-секвенирования был установлен факт наличияв том числе патогенной микрофлоры у подопытной птицы из третьей группы– были обнаружены стафилококкоки - 0,3 и кампилобактеры - 0,1, ни в контроле, ни во 2-ой подопытной группе никаких патогенных микроорганизмовтест не выявил. Так же в 3-ей группе было достаточно много транзитной микрофлоры, попавшей в пищеварительный тракт птицы с кормом и не играющейзначительной роли в процессах ферментации. Транзитная микрофлора, в данном случае относящаяся к псевдомонадам, в остальных группах не было выявлена.
По остальным показателям у птицы, получавшей специальную добавку, показатели по отдельным показателям микробиоты были ниже, чем вконтроле: целюлозолитики на – 5,3%, в т.ч. – лахноспиры – на 44,4%, руминококки – на 29,9% выше, чем у контроля, но на 19,6% ниже, чем у птицы из 2ой группы; клостридий на – 16,8%, бактероидов на – 24,11%, эубактерий на –50%, чем в контроле соответственно.Результаты определения структуры бактериального сообщества с помощью NGS секвенирования в опыте с включением 60% пшеницы по массе комбикорма представлены на рисунке 4.
На диаграмме отражено качественное иколичественное распределение автохтонных и аллохтонных микроорганизмовв составе бактериофлоры слепых отростков ЖКТ цыплят. Экспериментальнодоказано (Deng, P. 2014), что cлепые отростки кишечника птицы являются идеальным местом обитания для микрофлоры, которая оказывает значительное65влияние на питание и здоровье хозяина. Характерно, что в слепых отросткахкишечника кур содержится микробиом, состоящий преимущественно из бактерий (Wei, P. 2013). Ранее было обнаружено, что тонкий кишечник кур можетзаселяться лактобациллами (> 104 колониеобразующих единиц, КОЕ/г) и клостридиями (102-104 КОЕ/г), а в толстом кишечнике обитают, в основном, анаэробные бактерии (1010-1011 КОЕ/г) (Barnes, E.M.
et al., 1972; Salanitro, J.P. et al.,1974). Идентифицированные бактерии в основном представляют анаэробныеграмотрицательные бактерии, факультативные анаэробные кокки и стрептококки. Peptostreptococcus, Propionibacterium, Eubacterium, Bacteroides иClostridium являются основными родами, выделенными в чистую культуру измикрофлоры слепых отростков кишечника птицы.Использование методов секвенирования генов 16S рРНК, технологии секвенирования по Sanger и недавно созданных технологий секвенирования(NGS) нового поколения позволяет наиболее полно охарактеризовать кишечную микробиоту домашней птицы. Благодаря филогенетическому и статистическому анализу последовательностей генов 16S рРНК, выделенных из кишечного микробиома птиц, в настоящее время, создаётся глобальная каталогизация микробиома домашней птицы.
Так, с помощью методов секвенированиягенов 16S рРНК обнаружено, что большинство (> 90%) кишечных бактерийприходится на бактериоиды и протеобактерии. Доминируют также представители Clostridium, Ruminococcus и Lactobacillus, но в разном соотношении и уразных видов птицы (Wei, P., 2013). В изучении динамики баланса бактерий вслепом отростке ЖКТ тракта цыплят использован также T-RFLP – анализ(Terminal restriction fragment length polymorphism) – молекулярно – генетический метод, основанный на анализе полиморфизма длин амплифицированныхрестрикционных фрагментов гена 16S рРНК микроорганизмов. Он предназначен для определения количества, относительной численности и таксонометрической принадлежности бактерий исследованной микробной экосистемы.В группе 1 бактериофлоры ЖКТ цыплят, получавших комбикорм безвключения пшеницы, содержащий 60% кукурузы по массе комбикорма, cреди66автохтонных бактерий обнаружены бациллы (1%), молочнокислые и бифидобактерии (3,2%) и представители 5 семейств целлюлозолитических бактерий:лахноспиры, руминококки, клостридии, бактероиды и эубактерии.
Аллохтонную микрофлору представляли 4 семейства: энтеробактерии (1,9%), актиномицеты (2,0%), стафилококки (0,3%), кампилобактерии (0,1%). Практическивсе автохтонные микроорганизмы принадлежали к Гр (+) анаэробной бактериофлоре, за исключением бактероидов ((Гр () анаэробы) и лактобацилл((Гр(+) факультативные анаэробы или микроаэрофиллы).Рис.
4. Распределение доли микрофлоры в ЖКТ цыплят по данным NGS секвенирования при включении в рацион комбикорма с 60% кукурузы (группа 1к), комбикорма с 60% пшеницы (группа 2 о) и комбикорма с включением 60%пшеницы и ферментативного пробиотика Целлобактерин-Т (группа 3 о)Известно, что у птицы отсутствуют собственные пищеварительные ферменты для расщепления целлюлозы и некрахмалистых полисахаридов. Этофункцию выполняет группа целлюлозолитических бактерий в составе аутофлоры ЖКТ (Грозина A.A. 2014). В группу целлюлозолитиков вошли представители семейства Bacteroidaceae (бактероиды), Lachnospiraceae (лахноспиры),Ruminococcaceae (руминококки), Clostridiaceae (клостридии) и Eubacteritae67(эубактерии). Важно, что суммарное количество бактероидов, контролирующих кроме ферментации клетчатки и крахмалистые компоненты кормов (Тараканов Б.В., 2000) было довольно большим и составило 25,3%.Общая доля целлюлозолитических бактерий в слепых отростках ЖКТ исследуемых бройлеров при введении в рацион 60% пшеницы увеличилась на2,6% по сравнению с контролем.
Однако, обогащение корма биологически активным пробиотиком привело к снижению количества целлюлозолитиков на4,2%. Уменьшилась, по сравнению с контролем, доля лахноспир – на 0,8%,клостридий – на 4,5%, бактероидов – на 16,7%. Количество эубактерий осталось практически неизменным, а доля руминококков выросла на 7,3%. Необходимо отметить антибактериальное действие пробиотика, основанное навытеснении условно-патогенных и патогенных бактерий (Ноздрин Г.А., 2001;Beal R.K. 2006; Соколова И.П. 1999). Однако, в присутствии ЦеллобактеринаТ доля условно-патогенных бактерий увеличилась до 2,1% (в контроле 1,0%), а патогенных бактерий – до 0,4% (в контроле 0%).
Совокупная долятранзитных бактерий и некультивируемых видов в опыте и контроле практически не изменилась: 17,3% (группа 1), 15,5% (группа 2) и 17,8% (группа 3).Не совсем однозначные данные полученные NGS – анализом мы проверили при помощи T-RFLP-анализа, результаты которого представлены в таблице 11.Таблица 11. Микробиота кишечника бройлеров, определенная методомT-RFLP-анализа (опыт 1)Показатель1БациллыЛактобациллыБифидобактерииВейлионеллыЦеллюлозолитики, в т.ч.лахноспирыруминококкиклостридиибактероиды1- контрольная2Полезная микрофлора3,55 ± 1,186,59 ± 2,130,05 ± 0,0911,5 ± 2,2451,7 ± 2,763,62 ± 0,7911,6 ± 3,7215,5 ± 3,1810,1 ± 4,18Группа2-опытная35,26 ± 0,964,53 ± 0,75011,9 ± 2,5249,4 ± 1,31,17 ± 0,149,88 ± 2,0418 ± 1,1311,3 ± 2,513-опытная44,18 ± 5,8815,3 ± 1,6109,48 ± 2,4849,2 ± 3,340,65 ± 0,655,95 ± 3,415,1 ± 3,3716,5 ± 5,93681эубактерииЭнтеробактерииАктиномицетыФузобактерииЛистерииСтафилококкиКампилобактерПатогенные клостидииПастереллыПептококкиПсевдомонадыНекультивируемые2310,8 ± 1,958,39 ± 0,66Условно-патогенные бактерии1,82 ± 0,331,01 ± 0,862,41 ± 0,86,07 ± 1,45Патогенные бактерии4,2 ± 1,262,29 ± 0,560,03 ± 0,060,08 ± 0,111,85 ± 1,090,25 ± 0,010,22 ± 0,070,79 ± 0,040,71 ± 0,633,43 ± 0,430,51 ± 0,450,33 ± 0,280,09 ± 0,150,63 ± 0,07Транзитные бактерии3,31 ± 1,655,8 ± 0,37Некультивируемые виды9,69 ± 1,4310,5 ± 1,51410,7 ± 3,371,5 ± 1,512,39 ± 2,531,22 ± 0,580,16 ± 0,140,08 ± 0,130,13 ± 0,230,81 ± 0,680,32 ± 0,550,35 ± 0,325,66 ± 2,59,31 ± 2,92Аналогичные исследования по изучению динамики состава бактериального сообщества слепых отростков ЖКТ цыплят выполнены с помощью TRFLP-анализа и представлены на рисунке 5.Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
