Диссертация (1151541), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Достоверные разности в опытах обозначали: *р≤0,05, ** р≤0,01, *** р≤0,001.2.2. Методика T-RFLP- анализа микрофлоры желудочно-кишечноготракта птицыБольшинство сведений о микрофлоре, населяющей кишечник птицы,получено с использованием классических методов микробиологии, согласнокоторым основу микробного сообщества кишечника птицы составляют бифидобактерии, стрептококки, лактобактерии, лактат-ферментирующие бактерии,эубактерии, бактероиды и энтеробактерии (Тимошко М.А., 1990; Barnes E.M.et al, 1979).Уникальные возможности перед исследователем, изучающим составмикробиома кишечника птицы, открывают современные молекулярно-генети-51ческие методы, которые уже продемонстрировали, что в кишечнике птицы обнаруживаются представители до 140 родов бактерий, из которых только 10%идентифицированы по гену 16S рРНК, а остальные принадлежат к новым видам или даже новым родам (Amit-Romach E.
et al., 2004; Apajalahti J. et al.,2004).Одним из наиболее перспективных на сегодняшний день является TRFLP – анализ (Terminal restriction fragment length polymorphism) – молекулярно – генетический метод, основанный на анализе полиморфизма длин амплифицированных рестрикционных фрагментов гена 16S рРНК микроорганизмов. Он предназначен для определения количества, относительной численности и таксонометрической принадлежности всех бактерий микробной экосистемы. Это дает возможность широкого и глубокого изучения микробиологических сообществ в их развитии и изменении.В связи с этим сотрудниками лаборатории молекулярно-генетическихисследований ООО «БИОТРОФ» в 2008 году впервые в России на основе анализа зарубежных исследований (Torok, V.A.
et al., 2008) и отечественных данных (Ильина и др., 2015) методика T-RFLP была модифицирована для изучения микрофлоры желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных птиц.T-RFLP – анализ микрофлоры кишечника птицы включает следующие стадии(рис.1):1. Выделение общей (тотальной) ДНК микроорганизмов;2. ПЦР – амплификацию фрагментов генов бактерий (16S рДНК) с флуоресцентно-мечеными праймерами (обычно с 5’-конца);3. Ферментативную обработку амплификата с помощью эндонуклеаз рестрикции (обычно используют эндонуклеазы, узнающие последовательности из 4 нуклеотидов);4. Разделение полученных в результате рестрикции фрагментов ДНК в полиакриламидном геле в секвенаторе вместе с флуоресцентно меченымДНК-маркером известного размера.52Каждый пик T-RFLP – анализа отражает вид микроорганизма, а интенсивность флюоресценции пика – его процентное содержание в микробном сообществе.
Определение филогенетической принадлежности микроорганизмовпроводили с помощью программ и баз данных Arlequin, FragSort, TRAMPR иT-REX.Дополнить и расширить результаты T-RFLP- анализа позволяет RT-PCRанализ – молекулярно-генетический метод, основанный на полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени. Применение данного метода дает возможность провести количественное определениедоли микроорганизмов в сообществе.Рис. 1.
Стадии выполнения T-RFLP – анализа.Тотальную ДНК из образцов выделяли с помощью набора «GenomicDNA Purification Kit» («Fermentas, Inc.», Литва) согласно рекомендациям производителя.Для лизиса клеточных стенок микроорганизмов в стерильной микроцентрифужной пробирке Эппендорф объемом 1,5 мл к навеске 200 мкг пробы добавляли 400 мкл лизирующего раствора (lysis solution) и перемешивали смесьна вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия). Затем полученную смесь инкубировалив термошейкере при 65°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании.53Далее проводили процедуру преципитации с целью осаждения ДНК. Готовили раствор для преципитации ДНК (precipitation solution): к 720 мкл стерильной очищенной воды добавляли 80 мкл концентрированного раствора дляпреципитации.
Полученный раствор перемешивали на вортексе в течение 1-2мин.В каждую микроцентрифужную пробирку с пробой добавляли 800 мклготового раствора для преципитации ДНК, перемешивали смесь на мультивортексе (V-32, Biosan, Латвия на максимальной скорости и помещали в центрифугу.
Смесь центрифугировали на настольной центрифуге (Beckman Coulter,США) в течение 10 мин при 14000 оборотов.Полученную жидкую фазу тщательно и аккуратно удаляли из микроцентрифужных пробирок, осадок ДНК оставляли в пробирке.К осадку ДНК добавляли 100 мкл раствора хлорида натрия (NaCl solution), 300 мкл 96% этилового спирта и тщательно перемешивали на вортексе втечение 1-2 мин.Полученную смесь центрифугировали на настольной центрифуге в течение 10 мин при 14000 оборотов.
Жидкую фазу аккуратно удаляли из микроцентрифужных пробирок, осадок оставляли в пробирке. Далее осадок инкубировали в настольном термостате «Гном» при температуре 45°С до полного высушивания (5-10 мин).К осадку ДНК добавляли 100 мкл стерильной дистиллированной воды иперемешивали 1-2 мин на вортексе. Полученный раствор ДНК замораживалии хранили в холодильнике при температуре - 20°С до использования для дальнейших исследований.Качество препарата ДНК оценивают с использованием электрофореза,количество ДНК определяют с использованием метода флюоресценции придобавлении интеркалирующих красителей во флуорометре.Количественную оценку качества ДНК проводили при анализе флюоресценции при добавлении интеркалирующих красителей с использованием54флуориметра Qubit и набора реагентов для определения концентрации ДНКQuant-iT Assays.Для проведения анализа брали пробирки Эппендорф из набора Quant-iTAssays: для контрольного анализа и по количеству проб ДНК.
Далее готовилиреакционную смесь согласно рекомендациям изготовителя.Полученную реакционную смесь смешивали на вортексе в течение 2-3с. Затем инкубировали смесь 2 мин при комнатной температуре.По истечении времени инкубации пробирки помещали во флуориметр иснимали показания с прибора. Концентрацию ДНК в пробе пересчитывали последующей формуле:Концентрация ДНК = Результаты анализа Qubit*количество мкл пробыКоличество ДНК в результате выделения ДНК должно составлять 1-20нг/мкл.Качество препарата ДНК оценивали с использованием электрофореза в1%-агарозном геле.В каждую пробу ДНК (20 мкл) вносили 2 мкл буферного раствора длявнесения проб в гель.В каждую лунку агарозного геля, помещенного в камеру для электрофореза под электрофорезным буфером, вносили полученную смесь ДНК+раствор для внесения в гель.В крайние лунки на агарозный гель вносили по 3 мкл стандартного маркера (Gene Ruler или Mass Ruler, Fermentas) для оценки качественного составафрагментов ДНК.После электрофореза агарозный гель анализировали его в трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете при длине волны 260 нм и документировалипри помощи фотоаппарата или системы гель-документирования.Анализ гелей проводили в специальных защитных очках и в маске, атакже пользуясь защитным экраном трансиллюминатора.При анализе качества ДНК детектировали:- размер фрагментов ДНК (должен составлять 5-10 тыс.
п.н.);55- чистоту ДНК (ДНК должна быть мало фрагментирована).Полимеразная цепная реакция представляет собой процесс многократного увеличения числа копий (амплификация) фрагмента ДНК- мишени(ДНК), катализируемый in vitro термостабильной ДНК-полимеразой, и позволяет обнаружить специфичный участок генома микроорганизма.Для проведения ПЦР-амплификации подготавливали исходную смесьреагентов для предварительно определенного числа реакций в объеме 20 мкл:10Xбуфер для Tag-полимеразы, 30мМ MgCl2, 10пM каждого праймера, 2,5мМсмеси нуклеотидов, 5 ед.
Tag ДНК-полимеразы, 10 нг ДНК-матрицы и деионизированную воду до общего объема 20 мкл. Все реагенты находились в замороженном состоянии до процесса приготовления раствора.После разделения фрагментов ДНК электрофорезом и установленияместоположения полосы с нужным фрагментом ДНК под ультрафиолетовымсветом, н с помощью стерильного острого скальпеля вырезали полосу агарозного геля, содержащую необходимый фрагмент ДНК. Затем переносили полосу геля в стерильную микроцентрифужную пробирку.Очистка ДНК из полосы агарозного геля проводилась с использованиемнабора «Genomic DNA Purfication Kit» производства Fermentas (Литва).Количество и качество ДНК определяли с использованием флюоресценции при добавлении интеркалирующих красителей как описано выше.Количество ДНК в результате ПЦР-амплификации ДНК составляло неменее 10-20 нг/мкл.Для проведения ферментативного расщепления ДНК приготовляли реакционную смесь.В каждую пробирку добавляли следующие компоненты: 100-400 нг.
Меченой ДНК; 1,5 мкл буфера для рестрикции; 10 ед. рестриктазы, деионизированной воды – до 15 мкл. Смешивали смесь на вортексе-миксере в течение 1мин при 4000 об.Ферментативный гидролиз ДНК на фрагменты осуществляли в термостате при оптимальном времени и температуре для применяемой рестриктазы56согласно рекомендациям фирмы производителя. По истечении срока инкубирования ресткрикционную смесь для остановки реакции рестрикции прогревали 20 мин при температуре 72°С.Терминальные (меченые) фрагменты ДНКразделяли в условиях капиллярного электрофореза с использованием системыгенетического анализа.Для этого полученную смесь ДНК с рестриктазой вносили в пробиркуэппендорф, добавляли 1 мкл гликогена, 1,5 мкл 3М раствора ацетата натрия и40 мкл 96% спирта.
Полученную смесь в течение 2 мин смешивали в вортексе(CVP-2, BioSan, Латвия), затем центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин,удаляли жидкую фазу, а осадок инкубировали в термостате «Гном» (Россия)при температуре 450С до полного высушивания. Затем полученный осадокрастворяли в 10 мкл буфера для разделения SLS (Bechman Coulter). К каждойпробе ДНК добавляли 0,2 мкл контрольного маркера – набора для определенияразмера фрагментов ДНК – 600 («Size Standart 600», Beckman Coulter).
Полученную смесь перемешивали в вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия) в течение 12 мин, добавляли по 10 мкл минерального масла. Затем пробы помещали в автоматический секвенатор CEQ8000 (Bechman Coulter, США), снабженныйпрограммой подсчета длины фрагментов каждой пробы относительно заложенных в пробу стандартов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
