Диссертация (1151541), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Введение в каждую пробу контрольного маркера(«Size Standart 600», Beckman Coulter) позволило провести точное определениедлины рестрикционных фрагментов.Автоматический секвенатор снабжен компьютерной программой автоматического подсчета длины фрагментов, основанной на определении электрофоретической подвижности фрагментов каждой пробы относительно заложенных в пробу стандартов длины.
В автоматической системе капиллярногоэлектрофореза введение в каждую дорожку контрольного маркера – наборадля определения размера фрагментов ДНК- 600 («Size Standart 600», BeckmanCoulter) позволяет провести очень точное определение длины рестрикционныхфрагментов.57После проведения электрофореза его параметры хранятся в файлах, содержащих табулированные данные сканирования геля и его графическийимидж – электрофореграмму (рис.
2).Рис.2 Электрофореграмма бактериального сообщества слепых отростковбройлераНа первом этапе после получения данных T-RFLP производили проверку качества полученных T-RFLP- грамм. Интенсивность флуоресценциидолжна составлять 10-200 тыс. единиц, длина контрольных фрагментов – 600п.н. Затем проводили подсчет матрицы данных при помощи таблицы Exel. После этого определяли филогенетическую принадлежность микроорганизмов спомощью программы FragSort (http://mica.ibest.uidaho.edu).
Эта программаформировала сводную таблицу, в которой каждому пику присуждалось несколько возможных кандидатур микроорганизмов, имеющих соответствующие длины терминальных рестрикционных фрагментов гена 16SрРНК. Дляопределения точной таксономической принадлежности филотипов, использовались результаты обработки проб как минимум для трех эндонуклеаз (HaeIII,HhaI и MspI). Содержание филотипов микроорганизмов определяли при расчете процентной доли в микробном сообществе.582.3. Методики NGS- (высокопроизводительное секвенирование) и количественного ПЦР-анализа микрофлоры желудочно-кишечного трактаптицыNGS-секвенирование. Состав и структуру бактериального сообществаопределяли методом NGS-секвенирования.
Амплификацию проводили с использованием ДНК-амплификатора Verity («Life Technologies, Inc.», США) спраймерами, амплифицирующими фрагмент гена 16S pРНК: 343F 5'CTCCTACGGRRSGCAGCAG-3', 806R 5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'.Секвенирование осуществляли на геномном секвенаторе MiSeq («Illumina,Inc.», США) с использованием набора MiSeq Reagent Kit v3 («Illumina, Inc.»,США). Обработку ридов 2х300 нт и последовательностей ДНК проводили сиспользованием биоинформатической платформы «CLC Bio GW 7.0»(«Qiagen», Нидерланды). Химерные последовательности были исключены изанализа с помощью программы «USEARCH 7.0» (http://drive5.com/usearch/).Определение таксономической принадлежности микроорганизмов до родапроводили с применением программы RDP Classifier (https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp).Количественная ПЦР. Общее количество бактерий анализировали методом qPCR с использованием «Набора реактивов для проведения ПЦР-РВ вприсутствии интеркалирующего красителя EVA Green» (ЗАО «Синтол», Россия) и праймеров Eub338 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3', Eub518 5'ATTACCGCGGCTGCTGG-3' на детектирующем амплификаторе ДТ Lite-4(ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) при условиях: 95°С ‒ 3 мин (1 цикл);95°С ‒ 13 с, 57°С ‒ 13 с, 72°С ‒ 30 с (40 циклов).Математическую и статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2010.
Расчет экологических индексов доминирования Симпсона и биоразнообразияШеннона (Мэгарран, Э. 1992) , коэффициентов сходства Брея-Кертиса и кластерный анализ проводили в программе Past (http://folk.uio.no/ohammer/past/).59Биоинформатические методы обработки результатов исследований.В работе применяли ряд методов биоинформатики как для таксономическойидентификации последовательностей ДНК, так и для анализа полученных метагеномных данных.Таксономическая идентификация последовательностей ДНК. NGSсеквенирование.
С использованием биоинформатической платформы «CLCBio GW 7.0» («Qiagen», Нидерланды) проводили обработку ридов и последовательностей ДНК. Химерные последовательности исключали из анализа спомощью программы «USEARCH 7.0» (http://drive5.com/usearch/). Определение таксономической идентификации последовательностей для каждой ОТЕпроводили с использованием базы данных RDP Classifier(https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp).T-RFLP-анализ. Определение таксономической идентификации последовательностей для каждой ОТЕ проводили с помощью программы FragmentSorter (http://www.oardc.ohiostate.edu/trflpfragsort/index.php).Анализ метагеномных данных.
Для биоинформатического анализа метагеномных данных проводили кластерный анализ образцов с использованиемалгоритма «UPGMA», а также сравнительный анализ микробных сообществ сиспользованием методов многомерной статистики, в частности анализа главных компонентов PCoA (Principal Components Analysis) и анализа неметрического многомерного шкалирования (Non-metric MDS) с использованием программы Past (http://folk.uio.no/ohammer/past/). В качестве характеристики сравнения при кластерном анализе и анализе неметрического шкалирования в качестве меры сходства использовали экологический коэффициент сходстваБрея-Кертиса.603.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1. Продуктивность, переваримость и использование питательных веществ корма бройлерами, состояние микрофлоры желудочно-кишечноготракта при использовании в рационе кормов, содержащих кукурузу ипшеницу (опыт 1)Задачей данного научно-производственного опыта являлось определение состояния микрофлоры кишечника бройлеров на фоне ввода в рацион кукурузы и пшеницы. Основные зоотехнические показатели представлены в таблице 8.Таблица 8.
– Основные зоотехнические показатели опыта 1ГруппаПоказатели12контрольнаяопытнаяСохранность поголовья, %100,0100,0Живая масса бройлеров (г),в возрасте:суточные43,0±0,3143,0±0,3721- дневные864±19,2845±22,1Средняя живая масса в2150205336- дневном возрасте, гв том числе:петушки2390±32,11 2294±35,42*курочки1910±29,4 1812±33,17*Среднесуточный прирост живоймассы, гза 1–36 суток58,5355,83Потреблено корма всего, кг3,4103,742Затраты корма, на 1 кг прироста1,621,86живой массы, кг:3опытная100,043,0±0,34884±16,621372366±28,61908±25,958,173,4441,64Из таблицы следует, что сохранность цыплят-бройлеров, участвующихв эксперименте составляла 100%, как в контрольной, так и в подопытных группах.Живая масса цыплят зависела от структуры комбикорма. Так, замена кукурузы на пшеницу (опытная группа 2) способствовала снижению их живой61массы уже в 21-дневном возрасте на 2,2% по сравнению с группой 1 (контроль).
Обогащение аналогичного комбикорма Целлобактерином-Т (опытнаягруппа 3) способствовало устранению данных негативных последсвий влияния пшеницы по сравнению с кукурузой на рост бройлеров. Так, их живаямасса в опытной группе 3 оказалась выше, чем в опытной группе 2, на 4,6% посравнению с контрольной группой 1 –на 2,3%.К концу выращивания бройлеров данная тенденция сохранилась. Средняя живая масса 36-дневных бройлеров в опытной группе 2 оказалась ниже,чем в группе 1, на 4,5%. При этом живая масса курочек была меньше на 5,1%(Р≤0,05).
Включение в комбикорма с пшеницей Целлобактерина –Т способствовало увеличению средней живой массы птицы на 4,1% по сравнению сопытной группой 2. По отношению к контрольной группе разница по данномупоказателю составила всего 0,6%. Аналогичной была закономерность получена по живой массе курочек и петушков, которая была практически на уровнепоказателей группы 1.Птица опытной группы 2 потребляли корма на 9,7% больше, чем сверстники контрольной группы, тогда как в группе 3 данные различия были незначительными – 1,0%. По отношению к опытной группе 2 в группе 3 данныйпоказатель был меньше на 8,0%.Затраты корма на 1 кг прироста живой массы в опытной группе 2, получавшей пшеницу взамен куркурузы, оказались выше, чем в группе 1, на 14,8%,тогда как в опытной группе 3 – практически на уровне контроля.
Обогащениекомбикорма с пшеницей Целлобактерином-Т способствовали снижению данного показателя на 11,8%.Полученые результаты выращивания цыплят объясняют результаты балансового (физиологического) опыта, в котором была определна переваримоть и использвание питательных веществ корма бройлерами.Известно, что пшеница в отличие от кукурузы содержит больше некрахмалистых полисахаридов: 2,4% растворимых и 9% нерастворимых против 0,1и 8% (Choct, M,1997).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
