Диссертация (1141345), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Оставшееся количество фактора Xa катализирует отщепление паранитроанилина (рNА) от синтетического хромогенного субстрата. Абсорбциясвободного pNA, определяемая при 405 нм, обратно пропорциональнаактивности гепарина в плазме.Процесс идет по следующей схеме:АТIII (избыток) + гепарин ⇒АТIII-гепарин.56АТIII-гепарин + Xa (избыток) ⇒АТIII-гепарин-Xa+Xa (остаток).Субстрат-рNA + Xa (остаток) ⇒Пептид + рNA.Для определения анти-IIа активности гепаринаНабор предназначен для хромогенного амидолитического определенияанти-IIа активности нефракционированного высокомолекулярного гепаринав плазме крови.Антикоагуляторнаяактивностьгепаринаобусловленаеговзаимодействием с антитромбином III (AT-III). При связывании гепарина сАТ-III ингибиторный эффект, оказываемый антитромбином III на фактор IIа(тромбин), фактор Xa и другие сериновые протеазы, участвующие всвертывании крови, усиливается в несколько тысяч раз.Низкомолекулярные гепарины в меньшей степени катилизируютреакцию между AT-III и фактором IIa, чем реакцию инактивации фактора Xa.Нефракционированные высокомолекулярные гепарины катилизируют обереации в равной степени.Метод определения активности гепарина основан на способностикомплекса АТIII-гепарин нейтрализовать активированный фактор IIа.
Вданном случае скорость инактивации фактора IIa прямо пропорциональнаконцентрации гепарина, так как в избытке присутствуют как фактор IIa, так иAT-III. Таким образом, остаточная активность фактора IIa обратнопропорциональна концентрации гепарина.Оставшееся количество фактора IIa катализирует отщепление паранитроанилина(рNА)отсинтетическогохромогенногосубстрата,представлющего собой синтетический олигопептид, имитирующий фрагметестественного субстрата.Процесс идет по следующей схеме:АТIII (избыток) + гепарин ⇒АТIII-гепарин.57АТIII-гепарин + IIa (избыток) ⇒ АТIII-гепарин-IIa + IIa (остаток).Хромогенный субстрат-рNA + IIa (остаток) ⇒ Пептид + рNA.2.3.2.5 Методика определения анти-Ха активности гепарина2.3.2.5.1 Приготовление реагентов1. Рабочий буферный раствор.
Буфер концентрированный (5 мл) разводилидистиллированной водой в 20 раз (1:19). Рабочий буферный раствор должениметь рН=8,4 ± 0,05. Условия хранения: при температуре 2-8 оС не более 20дней.2. Рабочий раствор антитромбина III. Во флакон с лиофильно высушеннымантитромбином III вносили 1 мл дистиллированной воды и растворялисодержимое при осторожном покачивании. Реагент готов к проведениюанализа через 20 минут после разведения.3. Рабочий раствор фактора Ха. Во флакон с лиофильно высушеннымфактором Ха вносили 2 мл дистиллированной воды, растворяли приосторожном покачивании. Реагент готов к проведению анализа через 20минут после разведения.4. Раствор хромогенного субстрата.
Во флакон с хромогенным субстратомвносили 2 мл дистиллированной воды, растворяли при осторожномпокачивании. Реагент готов к проведению анализа через 20 минут послеразведения.Стабильность реагентов приведены в таблице 7.2.3.2.5.2 Приготовление плазмы контрольной и плазмкалибраторовВносили во флакон с плазмой контрольной или плазмой-калибратором1,0 мл дистиллированной воды и растворяли содержимое при осторожном58покачивании (избегать образования пены). Перед использованием растворплазмы выдерживали при комнатной температуре в течение 20 минут.Таблица 7.Стабильность реагентовРеагенты+2-8 оС+18-22 оС -18-20 оСРабочий раствор антитромбина III3 дня1 день2 мес.Рабочий раствор фактора Ха3 дня1 день2 мес.Раствор хромогенного субстрата10 дней2 дня2 мес.Стабильность плазмы контрольнойСрок годности со дня изготовления лиофильно высушенной плазмы –12 месяцев при условии хранения при температуре 2-8°С или приотрицательнойтемпературе(чтопредпочтительнее).Приготовленныйраствор плазмы-калибратора можно хранить во флаконе изготовителя:- не более 8 часов при температуре 2-8°С- не более 4 часов при комнатной температуре (18-22°С).Приготовленный раствор плазмы-калибратора можно разлить поаликвотам в пластиковые пробирки, плотно закрыть, заморозить в течение 1часа при температуре -18-22°С и хранить при этой температуре не более 1месяца.2.3.2.5.3ПостроениеииспользованиекалибровочногографикаДляпостроениякалибровочногографикаиспользуютплазмы-калибраторы с известными активностями низкомолекулярного гепарина.1.
Разводили исследуемую плазму или плазмы-калибраторы трех уровнейрабочим буферным раствором в 5 раза по схеме: 0,1 мл плазмы + 0,4 млрабочего буферного раствора. - Раствор 1:592. Непосредственно перед проведением анализа готовили реакционную смесьпо схеме - Раствор 2 (таблица 8):Таблица 8.Схема подготовки реакционной смесиРабочий буферный раствор400 мклРаствор антитромбина III100 мклРаствор I100 мклПроведение контроляПроверкуправильностипостроениякалибровочныхпрямыхсиспользованием плазм-калибраторов осуществляли с помощью контрольныхплазм 1 и 2.
Плазма контрольная анализировалась одновременно сисследуемыми образцами. Исследуемый контрольный материал долженукладываться в диапазон значений, указанных в паспорте на данную сериюплазмы контрольной (плазма 1: 0,60 – 0,74; плазма 2: 0,29-0,39).2.3.2.5.4 Проведение анализаАнализ проводили в пластиковых пробирках, прогретых при 37 оС.Ход анализа приведен в таблице 9.Таблица 9Ход анализа.Вносили в пробирку:ОбразецКюветасравненияРабочий раствор фактора Xa200 мкл---Раствор 2200 мкл---Рабочий буферный раствор---1000 мкл60Инкубировать при 37 оС точно 5 минутРаствор хромогенного субстрата200 мкл---400 мкл---Инкубировать при 37 оС точно 5 минут50 % раствор уксусной кислотыИзмеряли оптическую плотность образца против кюветы сравнения наУФ-спектрофотометре при длине волны 405 нм.
На оси ординат (Y) полинейной шкале откладывали величины оптической плотности, полученныедля каждой плазмы-калибратора, а на оси абсцисс (Х) по линейной шкалеоткладывали активность гепарина в анти-Xa единицах в мл плазмы.Калибровочный график должен быть линеен в интервале активностигепарина от 0 до 1,0 анти-Xaед/мл. Используя калибровочный график изначениеоптическойплотностиисследуемогообразцаопределялиактивность гепарина в анти-Xa единицах.
Построение калибровочногографика проводили в течение каждого рабочего дня.2.3.2.6. Методика определения анти-IIа активности гепарина2.3.2.6.1. Приготовление реагентов1. Рабочий раствор реагента Human Antithrombin III. Во флакон слиофильновысушеннымантитромбиномIIIвносили5млдистиллированной воды и растворяли содержимое при осторожномпокачивании.2. Рабочий раствор реагента Bovine Thrombin. Во флакон с лиофильновысушенным бычьим тромбином вносили 2 мл дистиллированнойводы, растворяли при осторожном покачивании.3. Раствор реагента SPECTROZYME® TH.
Во флакон с хромогеннымсубстратом вносили 2 мл дистиллированной воды, растворяли приосторожном покачивании.614. 0,9% раствор натрия хлорида. 0,9 г натрия хлорида растворяли в 100 млдистиллированной воды.5. Пулированная нормальная плазма. Во флакон вносили 1,0 млдистиллированной воды и растворяли содержимое при осторожномпокачивании, избегая образования пены. Перед использованиемраствор плазмы выдерживали при комнатной температуре в течение 20минут.Таблица 10.
Стабильность реагентов+2-8 оСРеагентыРабочийраствор-20 оСреагентаHuman 2 недели4 месяцреагентаBovine 2 недели4 месяцAntithrombin IIIРабочийрастворThrombinРаствор реагента SPECTROZYME® TH2 месяца6 месяцевПулированная нормальная плазма8 часов1 месяц2.3.2.6.2.ПостроениеииспользованиекалибровочногографикаДля построения калибровочного графика использовали калибровочныерастворы высокомолекулярного нефракционированного гепарина.1.
Исходный стандартный раствор. Раствор гепарина USP RS сактивностью 6 МЕ/мл.2. Приготовление калибровочных стандартов гепаринаТаблица 11.62АктивностьПулированнаяОбъемстандартногогепарина, МЕ/млнормальная плазма, мклраствора гепарина, мкл0,6900100 мкл 6,0 МЕ/мл0,3500500 мкл 0,6 МЕ/мл0,15500500 мкл 0,3 МЕ/мл0,0500-2.3.2.6.3. Проведение анализаПеред проведением анализа приготавливалиразведенияобразцовплазмы кроликов и калибровочных стандартов гепарина добавлением 25 мклплазмы или стандарта к 375 мкл реагента Human Antithrombin III.Процедура анализа.1.
вносили 200 мкл реагента Human Antithrombin III с помощьюодноканального дозатора в пробирку Эппендорфа на 2 мл.2. прибавляли 25 мкл разведения плазмы или стандарта гепарина3. смешивали и инкубировали при 37 оС в течение 2 минут4. добавляли 200 мкл реагента Bovine Thrombin5. смешивали и инкубировали при 37 оС в течение ровно 2 минут6. добавляли 200 мкл реагента SPECTROZYME® TH7.
смешивали и инкубировали при 37 оС в течение ровно 1 минуты8. добавляли 200 мкл ледяной уксусной кислоты, перемешивали9. добавляли 200 мкл воды дистиллированнойИзмеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре ПЭ5400УФ при длине волны 405 нм. В качестве раствора сравненияиспользовалась смесь, приготовленная в следующем порядке:1. 200 мкл ледяной уксусной кислоты2. 200 мкл реагента Human Antithrombin III633. 25 мкл пулированной нормальной плазмы, разведенной реагентом всоотношении 1:164. 200 мкл реагента Bovine Thrombin5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
