Диссертация (1141345), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Методика обладает достаточной точностью и селективностьюдля проведения определения анти-Ха и анти-IIа активности препаратовнизкомолекулярного гепарина (эноксапарина натрия) в условиях in vitro сиспользованием готовых наборов реагентов «Ренапарин-тест» методом схромогенными субстратами. И определения анти-Ха и анти-IIа активностипрепаратов низкомолекулярного гепарина (эноксапарина натрия) в условияхin vivo оптическим методом с помощью готовых наборов реагентов дляопределения анти-Ха активности гепарина «Реахром Гепарин» и дляопределения анти-IIа активности «ACTICHROME Heparin», относящихся кметодам УФ-спектрофотометрии.77ГЛАВА 4 АПРОБАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИ-Ха иАНТИ-IIa АКТИВНОСТИ ЭНОКСОПАРИНА НАТРИЯ В УСЛОВИЯХIN VITRO.В данной главе приводятся результаты количественного определенияанти-Ха и анти-IIа активности препаратов низкомолекулярного гепарина(эноксапарина натрия) с использованием готовых наборов реагентов«Ренапарин-тест» методом с хромогенными субстратами, заключение овзаимозаменяемости биоаналога на этапе количественного определения антиХаи анти-IIаактивности препаратов низкомолекулярного гепарина(эноксапарина натрия) с использованием готовых наборов реагентов«Ренапарин-тест» методом с хромогенными субстратами в условиях in vitro.4.1 Результаты и их обсуждениеВ ходе количественного определения анти-Ха и анти-IIа активностипрепаратовнизкомолекулярногогепарина(эноксапаринанатрия)сиспользованием готовых наборов реагентов «Ренапарин-тест» методом схромогенными субстратами, были получены величины анти-Xa активностидля исследуемого и референтного препаратов, которые составили 10049МЕ/мл и 10053 МЕ/мл, соответственно.
И величины анти-IIa активности дляисследуемого и референтного препаратов составили 3038 МЕ/мл и 3015МЕ/мл, соответственно. Соотношение величин активности анти-Ха к анти-IIадля исследуемого и референтного препаратов составило 3,31 и 3,33,соответственно. Эти значения соответствует нормам отношения активностейсогласно USP.Значения оптических плотностей для исследуемых и стандартных растворовприведены в таблицах 20-21 для определения активности анти-Xa и втаблицах 22-23 для определения активности анти-IIa.78Средние значения оптических плотностей для исследуемых и стандартныхрастворов приведены в таблицах 24-25 для определения активности анти-IIaи в таблицах 26-27 для определения активности анти-Xa .Таблица 20.Оптические плотности растворов для определения анти-Xa активностипрепарата НМГ- эноксапарин натрияРядНомер лунки в ряду11234-56--0,878 0,754 0,8042--------------------------------------------------0,636 0,885-0,717 0,809 0,8938120,625 0,8520,735 0,803 0,8837110,525 0,7260,724 0,813 0,8756100,502 0,7440,811 0,714 0,791590,537 0,7700,853 0,761 0,851480,507 0,7130,861 0,796 0,887370,638 0,872--0,724 0,812 0,8600,613 0,858«-» - незадействованная лунка планшета79Таблица 21.Оптические плотности растворов для определения анти-Xa активностипрепарата КлексанРяд Номер лунки в ряду1123456-789101112------------------------------------------------0,878 0,754 0,804 0,568 0,75820,861 0,796 0,887 0,534 0,73930,853 0,761 0,851 0,529 0,76940,811 0,714 0,791 0,417 0,78750,724 0,813 0,875 0,663 0,83860,735 0,803 0,883 0,565 0,86470,717 0,809 0,893 0,651 0,81580,724 0,812 0,860 0,642 0,866«-» - незадействованная лунка планшета80Таблица 22.Оптические плотности растворов для определения анти-IIa активностипрепарата Эноксапарин натрия.РядНомер лунки в ряду11-2-3-4-5-6-7-8-2340,598 0,7110,8090,885 0,6720,7890,795 0,5840,7930,867 0,6590,8120,658 0,7030,8460,643 0,7230,8320,533 0,7450,8380,556 0,6970,84156----------------780,579 0,8050,563 0,8350,532 0,8370,623 0,8420,684 0,8940,652 0,9050,718 0,9090,696 0,9149101112--------------------------------«-» - незадействованная лунка планшета81Таблица 23.Оптические плотности растворов для определения анти-IIa активностипрепарата КлексанРядНомер лунки в ряду11-2-3-4-5-6-7-8-234560,598 0,711 0,809 0,595 0,7860,885 0,672 0,789 0,556 0,7810,795 0,584 0,793 0,598 0,7600,867 0,659 0,812 0,576 0,7890,658 0,703 0,846 0,737 0,8290,643 0,723 0,832 0,689 0,9100,533 0,745 0,838 0,735 0,9130,556 0,697 0,841 0,673 0,874789101112------------------------------------------------«-» - незадействованная лунка планшетаТаблица 24.Средние значения оптических плотностей растворов для определения антиIIa активности препарата Эноксапарин натрия.РастворОптичесS2S3S4S5S6T1T2T3T4плот-0,5970,6560,7170,8000,8390,5740,6870,8290,905ность,550833585-каяср.
знач.82Таблица 25.Средние значения оптических плотностей растворов для определения антиIIa активности препарата Клексан.РастворОптическая S2S3S4S5S6R1R2R3R4плотность,ср. знач.0,5975 0,6565 0,7170 0,8008 0,8393 0,5813 0,7085 0,7790 0,8815Таблица 26.Средние значения оптических плотностей растворов для определения антиXa активности препарата Эноксапарин натрия.РастворОптическая S1S2S3S4S5T1T2T3T4плотность,ср. знач.0,7250 0,7563 0,8093 0,8333 0,8778 0,5178 0,6280 0,7383 0,8668Таблица 27.Средние значения оптических плотностей растворов для определения антиXa активности препарата Клексан.РастворОптическая S1S2S3S4S50,7250,7560,8090,8330,87703338R1R2R3R4плотность,ср.
знач.0,5120 0,6303 0,7633 0,8458834.2 Определение анти-Ха активности НМГ.В программе Microsoft Excel строили график, на котором по оси абсцисс(линейной)откладываливеличины,соответствующиеоптическимплотностям, а по оси ординат (логарифмической) – анти-Xa активностьстандартногообразцанизкомолекулярногогепарина(Рисунки2-3).Проводили линию тренда в диапазоне активности 0,2 – 0,04 МЕ/мл.Активность, МЕ/млКоэффициент корреляции линии тренда не должен быть ниже 0,98.y = 420e-10,5xR² = 0,9903Оптическая плотностьРисунок 2. Калибровочный график для определения анти-Хa активностипрепаратаИспользуя уравнение линии тренда по средним значениям оптическихплотностей рассчитывали анти-Xа активность исследуемого препарата сучетом разведений.
Результаты расчета активности для каждого разведенияисследуемого образца не различались между собой более чем на 10 %. В этомслучае за активность исследуемого препарата принималось среднее значениеактивностей, полученных для каждого разведения. В том случае, если длякакого-либо разведения полученное значение активности отличалось отостальных более чем на 10 %, его необходимо исключить из расчета среднего84значенияактивности.Результатыопределенияанти-Хаактивностиприведены в Таблицах 28-29.Таблица 28.Значения активности растворов для определения анти-Xa активностипрепарата Эноксапарин натрияРастворРастворT1T2T3T4Активность0,09740,06700,04610,029797451004910362100430,003,11-0,06разведения, МЕ/МЛАктивностьисходного раствора, МЕ/МЛАктивностьисходного раствора, ср. знач.Отклонение от ср.
знач., %10049-3,03Таблица 29.Значения активности растворов для определения анти-Xa активностипрепарата Клексан.РастворРастворАктивностьразведения, МЕ/МЛАктивностьисходного раствора, МЕ/МЛT1T2T3T40,09940,06650,04230,032099379972951810786-0,81-5,327,30Активностьисходного р-ра, ср. знач.Отклонение от ср.
знач., %10053-1,15854.3 Определение антиIIа активности НМГ.Определяли среднее значение оптических плотностей для параллельныхпроб разведений стандартного образца низкомолекулярного гепарина. Впрограмме Microsoft Excel cтроили график, на котором по оси абсцисс(линейной)откладываливеличины,соответствующиеоптическимплотностям (ОП), а по оси ординат (логарифмической) – анти-IIa активностьстандартного образца низкомолекулярного гепарина. Проводили линиютренда, которая в выбранных осях должна представлять собой прямуюлинию в диапазоне активности 0,05 – 0,015 МЕ/мл.
Коэффициент корреляцииАктивность, МЕ/мллинии тренда не должен быть ниже 0,98.y = 1,822e-6,363xR² = 0,991Оптическая плотностьРисунок 3. Калибровочный график для определения анти-IIa активностипрепарата.Используя уравнение линии тренда по средним значениям оптическихплотностей рассчитывали анти-IIа активность исследуемого препарата сучетом разведений. Результаты расчета активности для каждого разведения86исследуемого образца не различались между собой более чем на 10 %. В этомслучае за активность исследуемого препарата принималось среднее значениеактивностей, полученных для каждого разведения. В том случае, если длякакого-либо разведения полученное значение активности отличалось отостальных более чем на 10 %, его необходимо исключить из расчета среднегозначенияактивности.Результатыопределенияанти-IIАактивностиприведены в Таблицах 30-31.Таблица 30.Значения активности растворов для определения анти-IIa активностипрепарата Эноксапарин натрияРастворРастворАктивностьразведения, МЕ/МЛАктивностьисходного раствора, МЕ/МЛT1T2T3T40,03190,02080,01220,009231893124274430952,83-9,681,88Активностьисходного раствора, ср.
знач.Отклонение от ср. знач., %30384,97Таблица 31.Значения активности растворов для определения анти-IIa активностипрепарата Клексан.РастворРастворАктивностьразведения, МЕ/МЛАктивностьT1T2T3T40,0291 0,0182 0,01410,0096291332512734316287исходного раствора, МЕ/МЛАктивность3015исходного р-ра, ср. знач.Отклонение от ср. знач., %-3,38-9,324,887,83ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 4В ходе количественного определения анти-Ха и анти-IIа активностипрепаратов эноксапарина натрия по разработанной методике были полученывеличины анти-Ха и анти-IIа активности для исследуемого и референтногопрепаратов, соответствующие нормам отношения активностей по USP.Кроме того, было показано, что при анализе различных серийисследуемого и референтного препаратов данные соотношения не меняется отсерии к серии.
Таким образом, было установлено, что исследуемыйразрабатываемый препарат «Эноксапарин натрия» обладает межсерийнойоднородностью по величинам анти-Ха и анти-IIa активности in vitro, а такжеих соотношению (RSD не более 5 %).Таблица 32.Результаты определения анти-Ха и анти-IIа активности исследуемыхпрепаратовсерия №Эноксапарин натрия, активностьКлексан®, активностьанти-Ха анти-IIа соотношение анти-Хаанти-IIасоотношение110 4802 8403,6910 2642 6683,85210 0772 5903,8910 2972 5654,01310 5272 6803,9310 6722 7593,8749 8342 6603,7010 8432 7353,96510 6652 7883,8310 6342 7603,85610 3192 4934,1410 2252 6313,89Ср.знач.10 3172 6753,8610 4892 6863,91RSD,%3,014,754,322,482,941,6888В результате проведенного количественного определения анти-Ха ианти-IIа активности препаратов низкомолекулярного гепарина эноксапаринанатрия с использованием готовых наборов реагентов «Ренапарин-тест»методом с хромогенными субстратами, получили, что величины анти-Xaактивности для исследуемого и референтного препаратов составили 10049МЕ/мл и 10053 МЕ/мл, соответственно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
