Диссертация (1141345), страница 7

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 7)

Аналогичнопроводилиприготовлениесерииразведенийреферентногопрепаратанизкомолекулярного гепарина (растворы R1 – R4, Клексан).2.2.6 Ход анализа при определении анти-Ха активности НМГ.Определения проводили в полистирольных планшетах, помещая их втермошейкере при 37С.Вносили по 20 мкл раствора антитромбина III для определения анти-Xaактивности последовательно во 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й, 8-ой ряды лунокпланшета.Спомощьюодноканальнойпипеткибуферныйраствордляопределения холостой амидолитической активности (B), соответствующиеразведения стандартного образца низкомолекулярного гепарина (S1 – S5) иобразца испытуемого препарата (Т1 – Т4) вносили в объеме 20 мкл согласносхеме распределения, представленной в Таблице 1.Таблица 1.Схема распределения буферного раствора (В), разведения стандартногообразца НМГ гепарина (S1 – S5) и образца испытуемого препарата (Т1 – Т4)РядНомер лунки в ряду1234567891011121-BS2S4R1R3T1T3----2-BS2S4R1R3T1T3----3-BS2S4R1R3T1T3----4-BS2S4R1R3T1T3----5-S1S3S5R2R4T2T4----6-S1S3S5R2R4T2T4----397-S1S3S5R2R4T2T4----8-S1S3S5R2R4T2T4----«-» - незадействованная лунка планшетаВо 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й, 8-ой ряды лунок планшета вносили по 40мкл раствора фактора Ха и выдерживали в термошейкере при 37  0,5 С посекундомеру 2 мин.Во 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й, 8-ой ряды лунок планшета вносили по 100мкл раствора хромогенного субстрата для фактора Ха и инкубировали ровно4 мин при 370,5 С.Во 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й, 8-ой ряды лунок планшета вносили по по40 мкл 70% раствора кислоты уксусной для остановки реакции.

Порядоквнесения реактивов представлен в Таблице 2.Таблица 2.Порядок внесения реактивовРаствор антитромбина III для определения анти-Xa активности20мклОбразец препарата или стандарта20 мклРаствор фактора Ха40 мклИнкубация при 37С и перемешивании 2 минутыРаствор хромогенного субстрата для фактора Ха100 мклИнкубация при 37С и перемешивании 4 минутыКислота уксусная40 мкл402.2.7 Ход анализа при определении анти-IIа активности НМГ.Определения проводили в полистирольных планшетах, помещая их втермошейкер при 37 С.Вносили по 20 мкл раствора антитромбина III для определения анти-IIaактивности последовательно во 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й, 8-ой ряды лунокпланшета.Спомощьюодноканальнойпипеткибуферныйраствордляопределения холостой амидолитической активности (В), соответствующиеразведения стандартного образца низкомолекулярного гепарина (S2 - S6) иобразца испытуемого препарата (Т1 – Т4) вносили в объеме 20 мкл согласносхеме распределения, представленной в Таблице 3.Таблица 3.Схема распределения буферного раствора (В), разведения стандартногообразца НМГ гепарина (S2 - S6) и образца испытуемого препарата (Т1 – Т4)РядНомер лунки в ряду1234567891011121-BS3S5R1R3T1T3----2-BS3S5R1R3T1T3----3-BS3S5R1R3T1T3----4-BS3S5R1R3T1T3----5-S2S4S6R2R4T2T4----6-S2S4S6R2R4T2T4----417-S2S4S6R2R4T2T4----8-S2S4S6R2R4T2T4----«-» - незадействованная лунка планшетаВо 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й, 8-ой ряды лунок планшета вносили по 40мкл раствора тромбина и выдерживали в термошейкере при 37  0,5С посекундомеру 2 мин.Во 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й, 8-ой ряды лунок планшета вносили по 100мкл раствора хромогенного субстрата для тромбина и инкубировали ровно 4мин при 370,5С.Во 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й, 8-ой ряды лунок планшета вносили по 40мкл 70% раствора кислоты уксусной для остановки реакции.

Порядоквнесения реактивов представлен в Таблице 4. Пустые клетки в таблицесоответствуют неиспользуемым лункам планшета.Таблица 4.Порядок внесения реактивовРаствор антитромбина III для определения анти-IIa активности20мклОбразец препарата или стандарта20 мклРаствор фактора IIа40 мклИнкубация при 37С и перемешивании 2 минутыРаствор хромогенного субстрата для фактора IIа100 мклИнкубация при 37С и перемешивании 4 минутыКислота уксусная40 мкл42Измеряли оптическую плотность растворов при 405 нм с помощьюмикропланшетного ридера Mindray MR-96A, производитель ShenzhenMindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd..2.3 Разработка методики определения анти-Ха и анти-IIa активностиэноксапарина натрия в условиях in vivo.2.3.1 Биологический этап2.3.1.1 Нормативные ссылкиДанноеисследованиевыполненовсоответствиисПравиламилабораторной практики в Российской Федерации:1.

Руководство по экспертизе лекарственных средств. Под.ред. проф. А.Н.Миронова. Том I. - М.: Гриф и К, 2013. - 328 с.2. Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009«Принципы надлежащей лабораторной практики»;3. Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФот 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторнойпрактики»;4. Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучениюновых фармакологических веществ – 2-изд., перераб. и доп. – М.: ОАО«Издательство «Медицина», 2005. – 832 с.Эксперименты на животных проводились с соблюдением правовых иэтических норм обращения с животными в соответствии с правилами,принятымиЕвропейскойКонвенциейпозащитепозвоночныхживотных, используемых для экспериментальных и иных научныхцелей:5.

European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used forExperimental and other Scientific Purposes (ETS 123). Strasbourg, 1986.43Все процедуры выполнялись согласно утвержденному техническомузаданию, в соответствии со Стандартными операционными процедурамиНИИ фармации, а также с учетом санитарных правил по устройству,оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник(вивариев).2.3.1.2 Выбор животныхКролики являются одной из признанных экспериментальных моделейдля исследования фармакокинетики лекарственных средств, что отражено вофициальныхрегламентирующихдокументах(см.«Руководствопоэкспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологическихвеществ», 2005 г.).животных.ОбщееВ экспериментах использовали конвенциональныхколичествоживотных,используемоевданномисследовании: 8 кроликов-самцов породы шиншилла.

2 кролика былиоставлены в качестве резервных на случай необходимости введения вэксперимент дополнительных животных или замены выбывших в результатефорс-мажорных обстоятельств. Производители животных: питомник –«Манихино». Животные разведены специально и ранее не участвовали висследованиях.Производительживотныхпредоставляетданные(ветеринарное свидетельство) последнего контроля здоровья животных.2.3.1.3 Описание исследованияДля проведения исследования была сформирована группа животныхэкспериментальных животных – кроликов-самцов породы шиншилла,которым случайным образом было распределено применение препарата потаблице рандомизации животных (таблица №5):Таблица 5.

Схема рандомизации животныхЭтап IЭтап II1TR2RT3TR444RT5TR6RT7TR8RT«Т»-препарат - «Эноксапарин натрия раствор для иньекций 10000 антиХа МЕ/1мл»«R»-препарат- «Клексан® 8000 анти-Ха МЕ/0,8 мл»Входеисследованияживотныевсех экспериментальных группнаходились в идентичных условиях и подвергались абсолютно одинаковымвоздействиям.В соответствии с таблицей рандомизацииисследуемые био препаратывводили кроликам однократно подкожно в соответствии с СОП «Введениепрепаратовэкспериментальнымживотнымподкожно».Приэтомфиксировалось с точностью до минуты время введения исследуемогопрепарата.Забор венозной крови для определения концентрации исследуемыхпрепаратов производили у экспериментальных животных из ушной вены:- до введения препаратов;- через 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 и 24 часа после введения исследуемыхпрепаратов;Через 7 дней применялся второй препарат и проводился отбор крови по тойже схеме.Забор крови осуществлялся в соответствии с СОП «Забор крови уэкспериментальных животных» с помощью шприца инсулинового (1 мл 0,33мм (29 G) х 12,7 мм, шаг 2 ЕД BD Микро-Файн Плюс® Инсулиновый U-40).45Для забора крови использовались пластиковые пробирки для коагулологиина 3,8 % цитрате натрия (9 : 1) (размеры 13 х 75 мм, объем 4,0 мл).

Послезабора пробы крови центрифугировались в течение 20 минут при 3000об/мин., плазма переносилась в полипропиленовые пробирки, которыеплотно укупоривались и помещались в холодильник с температурой 4 °С допередачи их в аналитическую лабораторию (СОП «Хранение образцовкрови»).Транспортировка крови в лабораторию осуществлялась в термосе ссоблюдением температурного режима (4±2 °С) в соответствии с СОП«Транспортировка крови»).Объёмы взятых проб крови для определения эноксапарина составляли около0,5 мл.В ходе всего эксперимента у подопытных кроликов фиксировали массуи температуру тела.

Взвешивание и измерение температуры производилосьеженедельно перед взятием крови.Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощьюстандартных методов вариационной статистики с использованием критерияСтьюдента.2.3.1.4 Дозы и подготовка препарата для введенияИзучаемые препараты (или испытуемый, или рефернтный) вводилиоднократно в дозе 500 анти-Ха МЕ/1 мл (разведение 1 : 20) на кролика в видеинъекционного раствора подкожно согласно техническому заданию кданному исследованию. Разведения были получены доведением 0,5 млраствора препарата до 10 мл водой для инъекций.Раствор препарата объемом 0,5 мл помещали в стерильные колбыобъемом 10 мл и доводили водой для инъекций до метки, перемешивали.46Растворы набирали в шприц объемом 1 мл и вводили однократно в дозе500 анти-Ха МЕ/1 мл (разведение 1 : 20) на кролика в виде инъекционногораствораподкожносогласнотехническомузаданиюкданномуисследованию.Способ и процедура введения.Вэкспериментепоисследованиюфармакокинетикиизучаемыепрепараты вводили подкожно с помощью одноразового стерильного шприца.Место инъекции предварительно выбривали и обрабатывали 70 % растворомэтанола.

Процедура проводилась согласно СОП «Обработка места инъекцииу животного».2.3.1.5 Тест-система (животные и уход за ними)Начальные возраст и масса тела.В исследовании использованы животные одного возраста и повозможности одинаковой массы тела. Масса тела кроликов к началуисследования составила около 3200 г. (см. таблица 2)Клетки, подстилЖивотные содержались в индивидуальных клетках типа RC.КормЕжедневный стандартный рацион (сбалансированный комбикорм длякроликов, сено, свежие овощи).

Характеристики

Список файлов диссертации