Диссертация (1141345), страница 10
Текст из файла (страница 10)
200 мкл реагента SPECTROZYME® TH6. 200 мкл воды дистиллированнойИспользуя калибровочный график и значение оптической плотностиисследуемого образца определяли активность гепарина в анти-IIa единицах.Построение калибровочного графика проводили в течение каждого рабочегодня.2.3.2.6.4. Программное обеспечениеПрограммное(аналитическийобеспечениеУФ-спектрофотометрапрограммно-аппаратныйкомплексAnalysдля54УФ-спектрофотометра ПЭ-5400), версия 1.0, ООО «ПРОМЭКОЛАБ», РоссияВЫВОД К ГЛАВЕ 2Было приведено описание материалов и методов исследований:1.
Определенияанти-Хаианти-IIаактивностипрепаратовнизкомолекулярного гепарина (эноксапарина натрия) в условиях in vitro сиспользованием готовых наборов реагентов «Ренапарин-тест» методом схромогенными субстратами.2. Определенияанти-Хаианти-IIаактивностипрепаратовнизкомолекулярного гепарина (эноксапарина натрия) в условиях in vivoоптическим методом с помощью готовых наборов реагентов дляопределения анти-Ха активности гепарина «Реахром Гепарин» и дляопределения анти-IIа активности «ACTICHROME Heparin».64ГЛАВА 3.
ВАЛИДАЦИЯ РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДИКВалидацию методик определения анти-IIа и анти-Ха активностиэноксапарина натрия в препаратах и плазме крови кроликов проводилисогласно ГФ XIII ОФС "Валидация аналитических методик" по следующимхарактеристикам:прецизионностьспецифичность,(надвухуровнях:линейность,сходимость,правильность,промежуточнаяпрецизионность), аналитический диапазон.Для методик определения анти-IIа и анти-Ха активности в плазмекрови кроликов валидация проводилась как для методики в модификации дляпланшетного, так и кюветного УФ-спектрофотометра.3.1 СпецифичностьДля оценки специфичности методики определения активности анти-IIаи анти-Ха активности эноксапарина натрия в препаратах (in vitro) и плазмекрови кроликов (in vivo) для каждой из методик проводили определениеактивности для холостого образца (для определения анти-IIа и анти-Хаактивности эноксапарина натрия в препаратах в качестве холостого образцаиспользовали воду очищенную).
Для определения для анти-IIа и анти-Хаактивности эноксапарина натрия в качестве холостого образца использовалиинтактную плазму кроликов от 6 разных животных, а также интактнуюплазму крови человека, и рассчитывали в каждом из случаев сигнал УФ-СФМдля данного образца.Для каждой из разработанных методик отклик сигнала для холостогообразца, как для плазмы крови человека, так и плазмы крови кроликов,уровень анти-IIа и анти-Ха активности эноксапарина натрия не отличался отнуля.
Таким образом, было показано, что при использовании разныхбиологических матриц (плазма крови человека или кроликов) сохраняетсяспецифичность разработанной методики.653.2 ЛинейностьПроводили измерение анти-Ха и анти-IIа активности в условиях in vitroи in vivo.3.2.1 Определение анти-Ха активности НМГ in vitro.Готовили 5 образцов стандартных растворов эноксапарина натрия сактивностью 0,212 МЕ/мл, 0,141 МЕ/мл, 0,094 МЕ/мл, 0,0628 МЕ/мл, 0,0418МЕ/мл. Для построения калибровочных кривых использовали линейнуюрегрессию с нормированием 1/x. Проводили линию тренда в диапазонеактивности 0,2 – 0,04 МЕ/мл По полученным значениям был построен калибровочный график (рисунок 1) совместно с уравнением калибровочной кривой.
Коэффициент корреляции составил 0,98 для этого и последующихопределений. Во всех случаях была отмечена обратная пропорциональнаязависимость активности эноксапарина натрия от оптической плотностиобразца.Рекомендуемыекоординатыкалибровочныхграфиковбылиприведены в информационных материалах к реактивам, и различались дляоценки анти-IIа и анти-Ха активности.Рисунок 1- Калибровочный график для определения анти-Хa активностипрепарата.66Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных поуравнению линейной зависимости, от фактических значений, приведены втаблице 12.Таблица 12.Отклонения концентраций калибровочных растворов от фактическихзначений анти-Хa активностиАнти-Хаактивность, in vitro12345введено0,21200,14100,09400,06280,0418найдено0,20300,15200,09900,06810,0389RME, %-4,2453 7,80145,31918,4395-6,93783.2.2 Определение анти-IIа активности НМГ, in vitro.Проводили измерение оптической плотности 5 образцов стандартныхрастворов эноксапарина натрия с активностью 0,041 МЕ/мл, 0,0277 МЕ/мл,0,0184 МЕ/мл, 0,0123 МЕ/мл, 0,0082 МЕ/мл.
Для построения калибровочныхкривых использовали линейную регрессию с нормированием 1/x. Проводилилинию тренда в диапазоне активности активности 0,05 – 0,015 МЕ/мл. По полученным значениям был построен калибровочный график, приведенный нарисунке 4, совместно с уравнением калибровочной кривой. Коэффициенткорреляции составил 0,98.67Рисунок 3. Калибровочный график для определения анти-IIa активностипрепаратаОтклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных поуравнению линейной зависимости, от фактических значений, приведены втаблице 13.Таблица 13.Отклонения концентраций калибровочных растворов от фактическихзначений анти-IIa активностиАнти-IIаактивность, in vivo 12345введено0,04100,02770,01840,01230,0082найдено0,04300,02650,01770,01320,0077RME, %4,8780-4,3321-3,80437,3171-6,09763.2.3 Определение анти-Ха активности НМГ, in vivoПроводили измерение оптической плотности 3 образцов стандартныхрастворов эноксапарина натрия с активностью 0,00 МЕ/мл, 0,48 МЕ/мл, 0,9368МЕ/мл.Для построения калибровочных кривых использовали линейнуюрегрессию с нормированием 1/x.
Проводили линию тренда в диапазонеактивности от 0 до 1,0 анти-Xa ед/мл. По полученным значениям был построен калибровочный график, приведенный на рисунке 4, совместно с уравнением калибровочной кривой. Коэффициент корреляции составил 0,98.Рисунок 4. Калибровочный график зависимости оптической плотностиэноксапарина от его активностиОтклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных поуравнению линейной зависимости, от фактических значений, приведены втаблице 14.Таблица 14.Отклонения концентраций калибровочных растворов от фактическихзначений анти-Хa активностиАнти-Ха активность, in vivo123введено0,000,480,93найдено0,000,450,85RME, %0,00-6,25-8,60693.2.4 Определение анти-IIа активности НМГ, in vivoПроводили измерение оптической плотности 3 образцов стандартныхрастворов эноксапарина натрия с активностью 0,0150 МЕ/мл, 0,300 МЕ/мл,0,600 МЕ/мл.Для построения калибровочных кривых использовалилинейную регрессию с нормированием 1/x.
Проводили линию тренда вдиапазоне активности от 0 до 1,0 анти-Xa ед/мл. По полученным значениямбыл построен калибровочный график, приведенный на рисунке 5, совместнос уравнением калибровочной кривой. Коэффициент корреляции составил0,98.Рисунок 5. Калибровочный график для определения анти-IIa активностипрепаратаОтклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных поуравнению линейной зависимости, от фактических значений, приведены втаблице 15.70Таблица 15.Отклонения концентраций калибровочных растворов от фактическихзначений анти-IIa активностиАнти-IIаактивность,invivo1234введено0,0000,1500,3000,600найдено0,0000,1420,2710,652RME, %0,000-5,333-9,6678,6673.3 Правильность и прецизионность3.3.1. Определение анти-Ха активности НМГ in vitro.Проводили анализ 3 образцов активности стандартных растворовэноксараина натрия 0,212 МЕ/мл, 0,0940 МЕ/мл, 0,0418 МЕ/мл. Каждыйраствор измеряли на спектрофотометре 3 раза.
Исследование проводили вдвух последовательностях, с участием двух разных аналитиков. Дляполученныхзначенийконцентрацийбылирассчитанывеличиныстандартного отклонения (S.D.) и относительного стандартного отклонения(RSD, %) и относительной погрешности (ε, %), приведенные в Таблицах 16.Таблица 16.Величины S.D., RSD, %, RME значений анти-Xa активностиПрецизионность и правильность (inter-day).введено (МЕ/мл) найдено(МЕ/мл)найденоS.D.RSD, % ε, %(МЕ/мл),(n=3)(n=3)71среднеезначение(n=3)0,21200,18700,19570,01035,2452-7,70440,09400,00727,67140,00000,04620,00357,566810,4466найденоS.D.RSD, % ε, %(МЕ/мл),(n=6)(n=6)0,20580,01929,3321-2,90880,09330,00667,0561-0,74470,04320,00419,47793,26950,20700,19300,09400,08800,10200,09200,04180,04930,04240,0468Прецизионность и правильность (intra-day).введено (МЕ/мл) найдено(МЕ/мл)среднеезначение(n=6)0,21200,23900,21500,19400,09400,08980,10100,08700,04180,04200,03890,0396723.3.2.
Определение анти-IIа активности НМГ in vitro.Проводили анализ 3 образцов активности стандартных растворовэноксараина натрия 0,0410 МЕ/мл, 0,0184 МЕ/мл, 0,0082 МЕ/мл. Каждыйраствор измеряли на спектрофотометре 3 раза. Исследование проводили вдвух последовательностях, с участием двух разных аналитиков. Дляполученныхзначенийконцентрацийбылирассчитанывеличиныстандартного отклонения (S.D.) и относительного стандартного отклонения(RSD, %) и относительной погрешности (ε, %), приведенные в Таблицах 17.Таблица 17.Величины S.D., RSD, %, RME значений анти-IIa активностиПрецизионность и правильность (inter-day).введенонайденонайдено (МЕ/мл), S.D. (n=3)RSD, % ε, %(МЕ/мл)(МЕ/мл)среднее значение(n=3)(n=3)0,04100,04150,03960,00246,0659-3,41460,01830,00189,9137-0,36230,00840,00089,29792,43900,03690,04040,01840,01890,01630,01980,00820,00930,00790,0080Прецизионность и правильность (intra-day).73введенонайденонайдено (МЕ/мл), S.D.
(n=6)RSD, % ε, %(МЕ/мл)(МЕ/мл)среднее значение(n=6)(n=6)0,04100,04240,04000,00235,8438-2,43900,01830,00147,5445-0,45290,00840,00077,81902,23580,03730,04150,01840,01960,01720,01810,00820,00760,00860,00893.3.3. Определение анти-Ха активности НМГ in vivo.Проводили анализ 3 образцов активности стандартных растворовэноксараина натрия 0,00 МЕ/мл, 0,48 МЕ/мл, 0,93 МЕ/мл. Каждый растворизмеряли на спектрофотометре 3 раза. Исследование проводили в двухпоследовательностях, с участием двух разных аналитиков. Для полученныхзначенийконцентрацийбылирассчитанывеличиныстандартногоотклонения (S.D.) и относительного стандартного отклонения (RSD, %) иотносительной погрешности (ε, %), приведенные в Таблицах 18.Таблица 18.Величины S.D., RSD, %, RME значений анти-Xa активностиПрецизионность и правильность (inter-day).введенонайденонайдено(МЕ/мл), S.D.(МЕ/мл)(МЕ/мл)среднее значение (n=3)(n=3)RSD,ε, %%74(n=3)0,000,000,000,00------0,500,047,214,170,960,077,342,87RSD,ε, %0,000,000,480,530,460,510,930,950,891,03Прецизионность и правильность (intra-day).введенонайденонайдено(МЕ/мл), S.D.(МЕ/мл)(МЕ/мл)среднее значение (n=6)(n=6)%(n=6)0,000,000,000,00------0,490,059,402,080,950,066,072,150,000,000,480,510,520,410,930,880,960,99753.3.4.
Определение анти-IIа активности НМГ in vivo.Проводили анализ 3 образцов активности стандартных растворовэноксараина натрия 0,150МЕ/мл, 0,300МЕ/мл, 0,600МЕ/мл. Каждый растворизмеряли на спектрофотометре 3 раза. Исследование проводили в двухпоследовательностях, с участием двух разных аналитиков. Для полученныхзначенийконцентрацийбылирассчитанывеличиныстандартногоотклонения (S.D.) и относительного стандартного отклонения (RSD, %) иотносительной погрешности (ε, %), приведенные в Таблицах 19.Таблица 19.Величины S.D., RSD, %, RME значений анти-IIa активностиПрецизионность и правильность (inter-day).введенонайденонайдено (МЕ/мл), среднее S.D.RSD, % ε, %(МЕ/мл)(МЕ/мл)значение (n=3)(n=3)(n=3)0,1500,1700,1530,0159,9622,2220,3050,0113,4481,5560,6020,0152,5000,2780,1400,1500,3000,3150,2940,3050,6000,6160,5860,603Прецизионность и правильность (intra-day).введенонайденонайдено (МЕ/мл), среднее S.D.RSD, % ε, %(МЕ/мл)(МЕ/мл)значение (n=6)(n=6)(n=6)0,1500,1300,1500,0149,4280,000760,1500,1600,3000,3020,3040,0092,9771,2500,6030,0182,9200,5280,2940,3130,6000,6150,5780,621Полученные(прецизионность)величины относительного стандартного отклоненияиотносительнойпогрешности(правильность)соответствуют нормам (не более 10,00 %).ВЫВОД К ГЛАВЕ 3Проведена валидация методик количественного определения анти-Ха и антиIIa активности эноксапарина натрия методом УФ-спектрофотометрии.Разработанная методика была валидирована по следующим валидационнымхарактеристикам:специфичность,прецизионность, аналитический диапазон.основныевалидационныелинейность,правильность,По результатам исследованияхарактеристикисоответствуюткритериямприемлемости.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
