Диссертация (1141345), страница 6

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 6)

Для этого чащеиспользуются определения анти-Ха активности гепарина коагулологическимметодом и хромогенным методом.Определения анти-Ха активности гепарина коагулологическим методом.Метод основан на способности небольших количеств гепарина исследуемойплазмы в присутствии АТ III нейтрализовать экзогенный фактор Ха.Процесс происходит в два этапа:1. инактивация избытка фактора Xa комплексом АТ III-гепарин.2.

измерение коагулологической активности остаточного фактора Xa нафосфолипидной мембране в присутствии ионов кальция.Определение анти-Ха активности гепарина хромогенным методом. Методопределения активности гепарина основан на способности комплекса АТ IIIгепарин нейтрализовать фактор Ха. Активность гепарина определяют вплазме, добавляя к ней избыток АТ III и фактора Xa. При этом происходит31ингибирование фактора Xa комплексом АТ III-гепарин пропорциональноколичеству гепарина в плазме. Оставшееся количество фактора Xaкатализирует отщепление паранитроанилина (рNА) от синтетическогохромогенного субстрата, специфичного для фактора Ха.

Абсорбциясвободного pNA, определяемая при 405 нм, обратно пропорциональнаактивности гепарина в плазме. Для определения анти-Ха активностигепарина коагулометрическим или хромогенным методами в настоящеевремя существуют коммерчески доступные наборы реактивов [93,98].ВЫВОДЫ К РАЗДЕЛУ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1. На основании обзора существующих данных можно сделать вывод отом, что в настоящее время биотехнологические препараты весьмаширокоприменяютсявмедицине.Воспроизведенныебиотехнологические ЛС определяются термином «биоаналог», которыйвводится в проект поправок ФЗ №612. Перед регуляторными органами стоит серьезная задача правильнойоценки взаимозаменяемости биоаналогов при проведении процедурыгосударственнойсопоставимыхрегистрациирезультатовифармаконадзора,доклиническихчтотребуетиклиническихфармакокинетическихисследованийисследований.3.

Врамкахдоклиническихбиоаналогов возможно как прямое определение ЛС в плазме крови, таки косвенное определение по маркерам или по активности.4. Так для НМГ, широко применяемого в различных терапевтическихобластях, в европейской и американской ФК, в препаратах и плазмерекомендуется определение анти факторной активности с помощьювалидированного хромогенного метода, поскольку количественноеопределение НМГ в плазме затруднено.5. Изанализалитературныхданных,следует,чтоопределение,относящегося к группе НМГ, эноксапарина натрия следует проводить32на основании оценки его анти-Ха и анти-IIа активности методом схромогенными субстратами в условиях in vitro, а в плазме крови (invivo) оптическим методом.6. Эноксапарин натрия входит в список стратегически значимых ЛП, егопроизводство должно быть налажено. И для этого должны бытьпроведены сравнительные исследования для качественной оценкивзаимозаменяемости разрабатываемого биоаналога.ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫВ данной главе приводится описание материалов и методов проведенияколичественного определения анти-Ха и анти-IIа активности препаратовнизкомолекулярного гепарина (эноксапарина натрия) с использованиемготовых наборов реагентов «Ренапарин-тест» методом с хромогеннымисубстратами в условиях in vitro. И оптическим методом с помощью готовыхнаборов реагентов для определения анти-Ха и анти-IIа активности гепарина«Реахром Гепарин» в условиях in vivo.2.1 Объекты исследования:Исследуемый препарат:Препарат-биоаналог Эноксапарин натрия, раствор для инъекций 10000 антиХа российского производства, представлял собой прозрачный, бледножелтого цвета растворРеферентный препарат:Клексан®, раствор для инъекций 8000 анти-Ха МЕ/0,8 мл, серия 2SJ54, годендо 06.2015; представлял собой прозрачный, бледно-желтого цвета растворВ качестве действующего вещества исследуемое и референтноелекарственные средства содержат эноксапарин натрия.33Препарат обладает активностью не менее 90 и не более 125 анти-фактор Хамеждународных единиц (МЕ)/мг и не менее 20 и не более 35 анти-фактор IIаМЕ/мг в пересчете на сухое вещество.

Отношение анти-факторной Хаактивности к анти-факторной IIа-активности составляет от 3,3 до 5,3 [5].2.2 Разработка методики определения анти-Ха и анти-IIa активностиэноксапарина натрия в условиях in vitro.2.2.1 ОборудованиеОсновное оборудование Микропланшетный ридер Mindray MR-96A, производитель ShenzhenMindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.; рН/мВ-метр pH 330i; термошейкер Biosan PST-60HL для 96-луночных планшетов; вортекс-шейкер Heidolph, Reaxtop; дозаторы одноканальные переменного объема Ленпипет Лайт 10 – 100мкл, 100 – 1000 мкл, 1 – 10 мл; дозаторы восьмиканальные переменного объема Ленпипет Лайт 5 – 50мл и 30 – 300 мкл.Вспомогательное оборудование колбы мерные класса «А» вместимостью 10 мл; пипетки аналитические класса «AS» вместимостью 10 мл; пластиковые пробирки Eppendorf вместимостью 1,5 и 2 мл; пластиковые пробирки вместимостью 10 мл; 96-луночные планшеты Greiner.342.2.2 Реактивы вода деионизированная; кислота уксусная ледяная (Scharlau, Испания, класс «х.ч.»). Составнаборареагентовдляопределенияактивностинизкомолекулярного гепарина (серия 0312, годен до 12.2015): Антитромбин III (1 IU/фл), лиофильно высушенный – 3 флакона; Фактор Xa (15 нкат/фл), лиофильно высушенный – 1 флакон; Тромбин (фактор IIa) (20 NIH/фл), лиофильно высушенный – 1 флакон; Хромогенный субстрат для фактора Ха, лиофильно высушенный (2,0мл) – 2 флакона; Хромогенный субстрат для тромбина, лиофильно высушенный (2,0 мл)– 2 флакона; Рабочий Стандартный Образец НМГ – 1 флакон; Концентрат буфера (5 мл) – 1 флакон; Бычий сывороточный альбумин (1 г) – 1 флакон.2.2.3 Приготовление реагентов: Рабочий буферный раствор5 мл концентрата буфера вносили в мерную емкость вместимостью 100 мл,доводили водой дистиллированной до 80 мл, далее при перемешиванииколичественно вносили, при перемешивании, из флакона реактив БСА, затемперемешивали до полного растворения.

Доводили объем до 100 млдистиллированной водой и перемешивали. рН рабочего буферного раствора7,40 ± 0,05. Рабочий буферный раствор хранят при температуре +2-8 oС неболее 7 дней. 70% раствор кислоты уксусной3570 мл кислоты уксусной ледяной (класс «х.ч.») помещали в мерную колбувместимостью 100 мл, доводили объем раствора водой объем до метки иперемешивали. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 3месяцев. Раствор антитромбина III для определения анти-Ха активности1,0 мл рабочего буферного раствора вносили во флакон с лиофильновысушенным АТ III и при осторожном покачивании растворяли содержимое.Через 15 минут после разведения реагент готов к проведению анализа. Раствор антитромбина III для определения анти-IIа активностиВо флакон с лиофильно высушенным АТ III вносили 2,0 мл рабочегобуферного раствора и растворяли содержимое при осторожном покачивании.Реагент готов к проведению анализа через 15 минут после разведения. Раствор фактора Ха6,0 мл рабочего буферного раствора вносили во флакон с лиофильновысушенным фактором Ха, растворяли при осторожном покачивании.

Через15 минут после разведения реагент готов к проведению анализа. Раствор тромбина9,0 мл рабочего буферного раствора вносили во флакон с лиофильновысушенным тромбином, растворяли при осторожном покачивании. Через 15минут после разведения реагент готов к проведению анализа. Раствор хромогенного субстрата для фактора Ха6,0 мл дистиллированной воды вносили во флакон с хромогеннымсубстратом для фактора Ха, растворяли при осторожном покачивании. Через15 минут после разведения реагент готов к проведению анализа. Раствор хромогенного субстрата для тромбина366,0 мл дистиллированной воды вносили во флакон с хромогеннымсубстратом для тромбина, растворяли при осторожном покачивании.

Через15 минут после разведения реагент готов к проведению анализа. Раствор Рабочего Стандартного Образца НМГ1 мл дистиллированной воды вносили во флакон с Рабочим СтандартнымОбразцом низкомолекулярного гепарина и растворяли при осторожномпокачивании. В результате получали раствор с анти-Xa и анти-IIaактивностями, указанными в паспорте на набор. Через 15 минут послеразведения реагент готов к проведению анализа.2.2.4 Приготовление серии разведений рабочего стандартного образцаНМГ.В мерную колбу вместимостью 10 мл вносили около 9 мл рабочегобуферного раствора, 200 мкл раствора Рабочего Стандартного Образцанизкомолекулярногогепарина,перемешивалиидоводилирабочимбуферным раствором до метки (раствор препарата сравнения S1).1 мл раствора S1 помещали в микропробирку вместимостью 1,5 мл.Добавляли 0,5 мл буферного раствора и перемешивали (раствор препаратасравнения S2).1 мл раствора S2 помещали в микропробирку вместимостью 1,5 мл.Добавляли 0,5 мл буферного раствора и перемешивали (раствор препаратасравнения S3)1 мл раствора S3 помещали в микропробирку вместимостью 1,5 мл.Добавляли 0,5 мл буферного раствора и перемешивали (раствор препаратасравнения S4).1 мл раствора S4 помещали в микропробирку вместимостью 1,5 мл.

Добавлял0,5 мл буферного раствора и перемешивали (раствор препарата сравненияS5).371 мл раствора S5 помещали в микропробирку вместимостью 1,5 мл.Добавляли 0,5 мл буферного раствора и перемешивали (раствор препаратасравнения S6).Анти-Xa и анти-IIa активности в растворах препаратов сравнения S1 – S6указаны в паспорте на набор.Растворы S1 – S6 использовали сразу после приготовления.2.2.5 Приготовление серии разведений испытуемого препарата НМГ.В мерную колбу вместимостью 10 мл вносили около 9 млдистиллированной воды, 100 мкл исследуемого препарата (Эноксапариннатрия), перемешивали и доводили дистиллированной водой до метки(раствор 1).В мерную колбу вместимостью 10 мл вносили около 9 мл дистиллированнойводы, 100 мкл раствора 1, перемешивали и доводили дистиллированнойводой до метки (раствор 2).200 мкл раствора 2 помещали в микропробирку вместимостью 2 мл.Добавляли 1,8 мл буферного раствора и перемешивали (раствор испытуемойсубстанции Т1, рассчитанная активность около 0,1 МЕ/мл);1 мл раствора Т1помещали в микропробирку вместимостью 1,5 мл.Добавляли 0,5 мл буферного раствора и перемешивали (раствор Т2);1 мл раствора Т2помещали в микропробирку вместимостью 1,5 мл.Добавляли 0,5 мл буферного раствора и перемешивали (раствор Т3);1 мл раствора Т3 помещали в микропробирку вместимостью 1,5 мл.Добавляли 0,5 мл буферного раствора и перемешивали (раствор Т4).38Растворы Т1 – Т4 использовали сразу после приготовления.

Характеристики

Список файлов диссертации