Диссертация (1141345), страница 8

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 8)

Микробиологический статус кормовсоответствовал ГОСТ Р 51849-2001 «Ветеринарно-санитарные нормы итребования к качеству кормов для непродуктивных животных» и не оказывалнегативного влияния на результаты проводимого теста.ВодаВодопроводную воду давали adlibitum в стандартных поилках.Микробиологический статус воды соответствовал СанПиН 2.1.4.1074-0147«Гигиенические требования к качеству воды централизованных системпитьевого водоснабжения» и не оказывал негативного влияния на результатыпроводимого теста.Параметры окружающей средыЖивотных содержали в контролируемых условиях окружающей среды.Температура в помещении содержания животныхОтносительнаявлажностьсоставила55–составила 16 – 20 0С.65%.Освещенностьконтролировалась автоматически (12 часов свет, 12 часов темнота). В ходевсего эксперимента фиксировались основные показатели микроклиматапомещения, в котором содержались подопытные кролики (таблица 6).Таблица 6.Параметры микроклимата в помещении для лабораторных животных (кроликов).ДатаТемпература,ОтносительнаяКратностьград.

Cвлажность, %воздухообмена(проветривание)колеб.средн. колеб.среднеекол-вопродолжитпроветриваельность,ниймин09.12.1316-201855-656081010.12.1316-201855-656081011.12.1316-201855-656081012.12.1316-201855-656081013.12.1316-201855-656081014.12.1316-201855-656081015.12.1316-201855-656081016.12.1316-201855-656081017.12.1316-201855-656081018.12.1316-201855-65608104819.12.1316-201855-656081020.12.1316-201855-6560810КарантинВновь прибывших животных содержали в карантине 14 дней в клетках.Во время карантинного периода у них контролировали клиническиепризнаки здоровья.Идентификация животныхКаждая клетка с кроликом была снабжена табличкой, на которой былиуказаны номер и пол животного, название и дата введения изучаемогопрепарата, доза препарата.Наблюдения и измерения в ходе исследования фармакокинетикиЕжедневно регистрировались следующие параметры функциональногосостояния экспериментальных животных:Поведение:Активность – вялость, нормальная активность, повышенная активность;Потребление корма и воды – нормальное, сниженное, повышенное;Передвижение – нарушения координации, мышечный тонус, тремор.Внешний вид:Состояние – ожирение, норма, истощение, кахексия;Шерсть – блестящая, тусклая, гладкая, торчащая, выпадение шерсти;Глаза – слезотечение, воспаление помутнение роговицы, адгезия;Уши – цвет – норма, бледность, покраснение; воспаление, выделение секрета,образование струпа, подергивание;49Зубы – цвет, поломка, потеря;Конечности - цвет, отек.Физиологические функции:Дыхание - учащенное, нормальное замедленное, свистящее, хрипящее,затрудненное;Слюноотделение - недостаточное или избыточное;Слюна – водянистая или липкая;Моча – цвет;Экскрет – цвет, качествоВ ходе всего эксперимента у подопытных кроликов измеряли массу итемпературу тела.

Взвешивание и измерение температуры производилосьеженедельно перед взятием крови.Все измерения были в пределах нормы.2.3.1.6Заборкровидляопределенияконцентрациипрепаратов эноксапарина натрияВ ходе исследования фармакокинетики изучаемых лекарственныхпрепаратов эноксапарина натрия осуществляли забор венозной крови дляопределения концентрации эноксапарина натрия по схеме. Отбор проб кровиосуществляли из краевой ушной вены. График забора проб кровисоответствовал приведённому в разделе «5.3.

Описание исследования».Забор крови осуществлялся с помощью шприца инсулинового (1 мл0,33 мм (29G) х 12,7 мм, шаг 2 ЕД BD Микро-Файн Плюс® Инсулиновый U40).Длязаборакровииспользовалисьпластиковыепробиркидлякоагулологии на 3,8 % цитрате натрия (9 : 1) (размеры 13 х 75 мм, объем 4,0мл). После забора, пробы крови центрифугировались в течение 20 минут при503000 об/мин., плазма переносилась в полипропиленовые пробирки, которыеплотно укупоривались и помещались в холодильник с температурой 4 °С допередачи их в аналитическую лабораторию (СОП «Хранение образцовкрови»).Транспортировка крови в лабораторию осуществлялась в термосе ссоблюдением температурного режима (4±2°С) в соответствии с СОП«Транспортировка крови»).Объёмы взятых проб крови для определения эноксапарина натриясоставляли около 1 мл.Непосредственно при переносе плазмы в полипропиленовые пробиркиобъемом 0,5 мл для осуществления криохранения производилась маркировкаобразцов с целью максимального снижения вероятности ошибки примаркировке.Маркировку производили механически путем переноса отрывнойполосы с индивидуальным номером пробы со стандартной пробирки длязабора крови на полипропиленовую пробирку для криохранения.Всеобразцы плазмы регистрировались в компьютерной базе данных в форматеMSExcel с сохранением индивидуального 7-значного номера и рабочеймаркировки, содержащей указание на время и прочие обстоятельства заборапробы.

Обеспечение такого порядка маркировки в соответствии с СОП«Маркировка биологических образцов» дополнительно позволяет исключитьвлияние человеческого фактора на результат эксперимента.2.3.1.7 Статистический анализСтатистическаяобработкаполученныхданныхпроводиласьспомощью стандартных методов вариационной статистики с использованиемкритерия Стьюдента.512.3.1.8 Документация и архивированиеВсе первичные данные, полученные в эксперименте, заключительныйотчет и документация, относящаяся к исследованию, лабораторные журналыи прочие материалы по исследованию хранятся в архиве в течение 5 лет.2.3.2.

Аналитический этапВ данном разделе приводится описание и результаты исследования поопределению анти-Ха и анти –IIа активности гепарина в плазме кровикроликов для сравнительного фармакокинетического исследования.2.3.2.1 Нормативная документацияДанное исследование проводилось согласно следующим нормативнымдокументам:Руководство по экспертизе лекарственных средств.

Том IV. — М.:ПОЛИГРАФ-ПЛЮС, 2014 — 172 с.1. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Под. ред. проф.А.Н. Миронова. Том I. - М.: Гриф и К, 2013. - 328 с.2. Стандартнаяоперационнаяпроцедура1МГМУ-НИИФ-ЛР-006«Порядок количественного определения лекарственного вещества вбиологической жидкости».3. Методические указания «Оценка биоэквивалентности лекарственныхсредств».

Под ред. В.Г. Кукеса, В.П. Фисенко. М., МЗиСР России, 2008.4. Инструкция для наборов «Реахром Гепарин» (НПО «Ренам», Россия).При аудите исследования уполномоченным по качеству отклонений отперечисленной документации установлено не было.522.3.2.2 ОборудованиеОсновное оборудование УФ-спектрофотометр Agilent Technologies Cary 60 UV-Vis, США; рН-метр 728 рН lab, MetrohmAG, Швейцария (свидетельство о поверкеот 04.03.2013, действительно до 04.03.2014 г.); УФ-спектрофотометр ПЭ-5400УФ, ПРОМЭКОЛАБ, Санкт-Петербург,серийный номер 1011019; Вортекс-шейкер Heidolph, Reax top; дозатор переменного объема ЛенпипетЛайт 100 – 1000 мкл, Россия(заводской номер ВР64381, первичная поверка от 03.07.2013 г.,действительно до 03.07.2014 г.); дозатор переменного объема ЛенпипетЛайт 20 – 200 мкл, Россия(заводской номер ВР60248, первичная поверка от 17.05.2013 г.,действительно до 21.05.2014 г.); термошейкерBiosanTS-100С, Латвия.Вспомогательное оборудование система водоподготовки Millipore, Франция; пластиковые пробирки Eppendorf вместимостью 1,5 и 2 мл; колбы мерные класса «А» вместимостью 100 мл и 250 мл2.3.2.3 Реактивы уксусная кислота ледяная (Scharlau, Испания, класс «х.ч.»); натрия хлорид (Scharlau, Испания, класс «х.ч.»);53 набор реагентов для определения анти-Ха активности гепаринаоптическим методом «Реахром Гепарин» (НПО «Ренам», Россия),серия 10 12, годен до 05.2015 г.; набор реагентов для определения анти-IIа активности гепаринаоптическим методом «ACTICHROME® Heparin (anti-IIa)» (SekisuiDiagnostics, Германия), годен до 14.03.2016 г.; плазма-калибратор для определения анти-Ха активности гепарина(НПО «Ренам», Россия), серия № 09 13, годен до 03.2015 г.; набор контрольных плазм для определения анти-Ха активностигепарина (НПО «Ренам», Россия), серия № 10 13, годен до 03.2015 г. Гепарин-натрий стандарт USP RS; Пулированная нормальная плазма, не содержащая гепарин, собрана от20 доноров в возрасте 20-40 лет, стабилизирована HEPES-цитратнымбуфером, лиофильно высушена (использовалась плазма уровня 0 изплазм-калибраторов в составе набора реагентов для определения антиХа активности гепарина оптическим методом «Реахром Гепарин»(НПО «Ренам», Россия, каталожный номер ГП-1), серия № 12 15, годендо 07.2017 г., МБООИ Общество больных гемофилией НПО РЕНАМСостав набора реагентов для определения анти-Ха активности гепаринаоптическим методом «Реахром Гепарин» Антиромбин III (1 мл), лиофильно высушенный – 2 фл. Фактор Xa (2 мл), лиофильно высушенный – 2 фл. Буфер концентрированный (5мл) – 1фл. Хромогенный субстрат, лиофильно высушенный (2 мл) – 2фл54Состав набора плазм-калибраторов для определения анти-Ха активностигепаринаПлазма-калибратор, пулированная, собрана от 20 доноров в возрасте20-40 лет,стабилизированаразличныеколичестваHEPES-цитратнымнизкомолекулярногобуфером,гепарина,исодержащаялиофильновысушена. Плазма-калибратор, уровень 0 – 2 фл. Плазма-калибратор, уровень 1 – 2 фл. Плазма-калибратор, уровень 2 – 2 фл.Флаконы силиконированы для предотвращения контактной активации.Состав набора плазм контрольных для определения анти-Ха активностигепаринаПлазма контрольная, пулированная, собрана от 20 доноров в возрасте20-40 лет,стабилизированаразличныеколичестваHEPES-цитратнымнизкомолекулярногобуфером,гепарина,исодержащаялиофильновысушена. Плазма контрольная, 1 – 3 фл. Плазма контрольная, 2 – 3 фл. Флаконы силиконированы для предотвращения контактной активации.Состав набора реагентов для определения анти-IIа активности гепаринаоптическим методом «ACTICHROME® Heparin (anti-IIa)» Human Antithrombin III, лиофильно высушенный (5 мл) – 6 фл. Bovine Thrombin, лиофильно высушенный (2 мл) – 6 фл. SPECTROZYME® TH, лиофильно высушенный (2 мл) – 6 фл.552.3.2.4 Принцип методаДля определения анти-Ха активности гепаринаНабор предназначен для определения анти-Ха активности гепарина как нефракционированного, так и низкомолекулярного, в плазме крови.

Основнымингибитором тромбина, активированного фактора Xa и других сериновыхпротеаз коагуляционного каскада является антитромбин III (ATIII). Внормальных условиях скорость ингибирования мала, но она возрастает внесколько тысяч раз в присутствии гепарина. Этот механизм объясняетантикоагулянтноедействиегепарина.Препаратынизкомолекулярногогепарина в комплексе с АТIII ингибируют действие активированного фактораXа в гораздо большей степени, чем тромбина. По этой причине тестингибирования активности фактора Xa является наиболее чувствительным иинформативным из всех способов определения активности гепарина в плазмекрови.Метод определения активности гепарина основан на способностикомплекса АТIII-гепарин нейтрализовать активированный фактор Ха.Активность гепарина определяют в плазме, добавляя к ней избытокантитромбина III и фактора Xa. При этом происходит ингибирование фактораXa комплексом АТIII-гепарин пропорционально количеству гепарина вплазме.

Характеристики

Список файлов диссертации