Диссертация (1141345), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Измерение помаркеру – неоптерину.1.5 Методы количественного определения НМГ в препаратах ибиожидкостях.Гепаринпредставляетсобойкислыймукополисахарид,вырабатываемый тучными клетками и осуществляющий функции медиатораво всех органах человека и животных и многих биологических жидкостях. Вего структуру входят несколько линейных полисахаридных цепей смолекулярной массой 5000-30000 Да, состоящих из остатков глюкуроновойкислоты и глюкозамина, этерифицированных серной кислотой[105].В клинической практике применяют два вида гепарина – стандартный(нефракционный) и низкомолекулярный.
В начале 70-х годов ХХ века былоначато фракционирование НФГ с выделением фракций гепарина с меньшеймолекулярной массой – получение низкомолекулярного гепарина (НМГ)[105]. Низкомолекулярные гепарины тормозят каскад свертывания крови наболее высокой ступени – на уровне фактора Ха, имеют высокуюбиодоступность – более 90% после глубокой подкожной инъекции. Однакоони тормозят и образование некоторого количества тромбина, что можетпривести к развитию тромбоцитопении.Лабораторный контроль гепаринотерапии необходим для минимизациирискаразвитиякровотеченийприпередозировкеиоптимизации25антитромбического лечения.
Правильность определения активности гепаринакрайне важна для производителей лекарственных форм данного соединения[53,68]. Рациональность использования антигепаринатов, главным образом,зависит от точности и скорости получения информации о количествециркулирующего в кровотоке гепарина, что является основной проблемойбезопасного использования гепарина как антикоагулянта.Анализ гепарина является сложной задачей из-за неоднородностисоединения, размера молекулы и распределения в ней заряда дисперсии[58,69]. Существует ряд методов определения гепарина в разных объектахискусственного и природного происхождения.
В настоящее время можновыделить биологические и химические методы анализа. Химические же всвою очередь включают в себя три основные группы: спектральные,хроматографические и электрохимические [59-66].К первой группе относится большая часть описанных в литературеметодов. Эти методы (коагуляционные методы) основаны на определенииингибирующего эффекта гепарина по отношению к тромбину или факторуХа.Послеинкубационногопериодавыпадениесгусткавызываетсядобавлением реактивов, содержащих фосфолипиды с адсорбированным на нихфактором V, протромбином, фибриногеном из бычьей плазмы и СаС12.Автоматизация этого метода затруднена, так как сигнал достаточно слабый дляоптического метода. Тест может выполняться на цельной крови накоагулометрах с механической системой регистрации [59-66].Ко второй группе относятся химические методы, которые измеряют восновном количество гепарина как вещества, а не его антикоагулянтнуюактивность.Для определения концентрации гепарина в плазме крови применяюттакже методы, основанные на использовании хромогенных пептидныхсубстратов, специфичных по отношению к тромбину или фактору Ха.
В этихтестаххромогенныепептидныесубстратывыступаютвкачестве«репортерных» молекул, по изменению оптических свойств которых26(колориметрических или флюорометрических) можно следить за скоростьюкатализируемойгепариномферментативнойреакцииинактивацииантитромбина или фактора Ха антитромбином III. Условия проведения тестаподбирают таким образом, чтобы скорость ферментативной реакции быласвязана линейной зависимостью с уровнем гепарина в образце. Однако нарезультатыанализов,проводимыхсиспользованиемхромогенныхпептидных субстратов, оказывает влияние связывание гепарина с белковымикомпонентами плазмы, имеющими антигепариновую природу [95,96].
Тестможет выполняться в разных модификациях: как кинетический метод,определение по начальной скорости или метод по конечной точке. Внекоторых тестах используется насыщающая концентрация AT, тогда тестобозначается как «общий гепарин», в других – используется эндогенный ATпробы, в этих случаях тест обозначается как набор для определениякомплекса гепарин-АТ, или «активный гепарин». Определение гепарина сиспользованиемхромогенныхсубстратовавтоматических биохимических анализаторов.легкоадаптируетсядляНа результаты теста схромогенными субстратами не оказывают влияния продукты деградациифибрина (ПДФ) и повышенное содержание фактора VIII, которые меняютрезультаты при определении АЧТВ.Для тестов на определение гепарина разработаны и промышленновыпускаются калибраторы – лиофильно высушенные препараты плазмы состандартным содержанием гепарина.
Калибраторы должны быть тестированыпо стандарту ВОЗ, которому придано значение активности 1,0 анти-Ха-Ед/мл[95,96].Колориметрическийгепаринахарактеризуютсяифлюорометрическийболеевысокойметодыточностьюиопределениястабильнойчувствительностью к гепарину (до 0,01 ЕД/мл) по сравнению с методами,основанными на процессе образовании сгустка, являются более удобнымидля клинического обследования и контроля, но вследствие их сложности идостаточно высокой стоимости их постановка возможна только в хорошо27оснащенныхспециализированныхлабораториях,располагающихдорогостоящим оборудованием и высококвалифицированным персоналом.Известны химические методы, с помощью которых измеряют восновном количество гепарина как вещества, а не его антикоагулянтнуюактивность, и основаны на детекции гепарина как мукополисахарида.Для этого, например, используют карбазольную реакцию гексуроновойкислотыилиацетилацетоновуюконденсациюгексозаминовсколичественным определением последующих пиррольных производных(дериватов) при помощи п-диметиламинобензальдегида (реагент Эрлиха).Эти методы непригодны для определения гепарина в плазме крови,характеризуются длительностью проведения анализа от 1 часа и более, иотличаютсяневысокойчувствительностью:сихпомощьюможнообнаружить концентрации гепарина более 12 мкг/мл или 1,6 ЕД/мл.Еще одна группа химических методов основана на способностигепарина как мукополисахарида вызывать метахроматический эффект приего взаимодействии с некоторыми основными красителями – азуром А,толуидиновымсиним,карбоцианиновымкрасителем.Интенсивностьметахромазии при образовании комплекса «гепарин - краситель» приоптимальной концентрации и объеме раствора добавленного красителяпропорциональна концентрации гепарина, и эта величина может бытьопределена спектрофотометрически.
Минимальная концентрация гепарина,определяемая при помощи метахроматических методов, составляет ~10мкг/мл или 1,0 ЕД/мл его активности. Относительная ошибка определенияконцентрации гепарина при помощи этой группы методов составляет 1015%.Однако метахроматические методы, как и методы, основанные наиспользовании специфических в отношении гепарина химических реакций,также непригодны для определения гепарина в плазме крови, достаточнодороги, обладают плохой воспроизводимостью и недостаточно точны.Последние два недостатка обусловлены преципитацией образующегося28комплекса «гепарин - краситель» и чувствительностью показаний абсорбцииэтого комплекса к температуре [96].Процесс производства НМГ требует контроля по функциональнойактивности гепарина в исходной субстанции, полупродуктах и целевыхпрепаратахНМГ.Эффективностьпроизводствафармацевтическихпрепаратов во многом зависит от контроля качества выполняемых работ.Современная система обеспечения качества производства предъявляет, вчастности, соответствующие требования к определению биологическиактивного вещества в субстанциях и готовых лекарственных формах.СогласноруководствамВОЗиЕвропейскойфармакопеиктакимтребованиям относятся выбор специфических и избирательных методовизмерения, аттестация и чистота компонентов используемых тест-систем,аналитическая валидация применяемой методики по ряду характеристик(правильность,Европейскойточность,воспроизводимость,Фармакопеей7.0рекомендованлинейностьихромогенныйдр.).методколичественной идентификации НМГ по измерениям анти-Ха и анти-IIаактивности [21].Применение пробы на анти-Ха активность в плазме больных являетсяпрактически единственным способом измерения активности НМГ.
Анализ спомощью АЧТВ малоинформативен, так как удлинение АЧТВ для НМГминимально. Повышение точности и правильности результатов определенияактивностиНМГизмеренийвМеждународныхрекомендуетсяэтимиметодамиосновномстандартов.засчетДлявалидированныйобеспечиваетсястандартизациейприменениясоответствующихтестированияхромогенныйНМГметодвпрепаратахопределенияфункционально активного НМГ и соответствующая тест-система на основеполученных высокоочищенных и аттестованных реагентов.
Метод описан вЕвропейской фармакопее и позволяет измерять ингибиторную активностьгепарина в препаратах и субстанциях НМГ как по конечной точке, так и по29кинетике процесса. Также метод описан в официальной монографииФармакопеи США «Эноксапарин натрия» [69].1.6 Свойства и определение эноксапарина натрияОтноситсякгруппенизкомолекулярныхгепаринов(НМГ)молекулярной массой около 4500 дальтон. Эноксапарин натрия представляетсобой натриевую соль деполимеризованного гепарина.
Препарат получаютпутем щелочной деполимеризации бензилового эфира гепарина. Исходныйматериал гепарин получают из слизистой оболочки кишечника свиньи.Основные компоненты содержат 4-енопиранозил-уронатную структуру приневосстанавливающем конце их цепочек. Препарат обладает активностью неменее 90 и не более 125 анти-фактор Ха международных единиц (МЕ)/мг ине менее 20 и не более 35 анти-фактор IIа МЕ/мг в пересчете на сухоевещество. Отношение анти-факторной Ха-активности к анти-факторной IIаактивности составляет от 3,3 до 5,3 [25,95].Рисунок 1.
Структурная формула Эноксапарина натрияОказываетантитромботическоедействие.Обладаетвыраженнойактивностью в отношении фактора Xa и слабой активностью в отношении30фактора IIa. В отличие от нефракционированного стандартного гепаринаантиагрегантная активность выражена сильнее, чем антикоагулянтнаяактивность. Не оказывает влияния на агрегацию тромбоцитов. Посколькуколичественноеопределениегепаринавбиологическихжидкостяхзатруднено [27], фармакокинетику эноксапарина натрия проводят наосновании оценки его активности. На основании анализа литературныхданныхрекомендуетсяпроводитьопределениеактивностигепаринаследующими методами[15,27]:Определение НМГ в препаратах и субстанциях хромогенным методом.Метод описан в Европейской фармакопее [17] и позволяет измерятьингибиторную активность гепарина в препаратах и субстанциях НМГ как поконечной точке, так и по кинетике процесса.
В качестве реагентовиспользуют тромбин (фактор IIa), фактор Ха и АТ III (Антитромбин III(ATIII) или ко-фактор гепарина – основной антагонист тромбина приобразовании этого фермента в крови), а также специфические для тромбина ифактора Xа хромогенные субстраты. К сожалению, данный метод не являетсяпригодным для определения гепарина в плазме крови.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
