Диссертация (1136963), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Каждая из методик представляетсобой эффективный инструмент трансформации природного объекта всимвол, и в конечном итоге, способ конструирования научного факта.78На примере этих методик мы кратко опишем, в чем состоитдеятельность лаборатории, а также рассмотрим, как именно каждыйметодструктурируетпространствовзаимодействийвнутрилаборатории:- Метод флюоресцентной гибридизации in situ (в искусственныхусловиях)Обратимсяквышеупомянутомудиссертационномуисследованию. Объектом исследования были выбраны два родарастений семейства злаковых — род зубровка99 и род душистыйколосок100.
Растения двух этих родов содержат в своем составевещество под названием кумарин101 и имеют схожую морфологию. Вбиологическойлитературесуществуютдваподхода:одниисследователи определяют эти роды как относящиеся к одной трибе,другие,наоборот,разделяют.Такимобразом,первоначальнаяпроблема исследования была заявлена как поиск родственныхпризнаков двух родов растений.На первом этапе из экспедиции привозятся семена и гербарии.Каждый конверт с материалом аккуратно пронумерован и подписан:латинское название, когда собран, кому принадлежит. Конверты ссеменами и листьями будут вложены в большие канцелярские папки,которые, в свою очередь, имеют наименование: место проведенияэкспедиции, даты.
Диссертант достает с полки большую папку,находит среди одинаковых конвертов нужное обозначение. Открываяконверт,оннаполненнуюобнаруживаетсемена.водойПетри,чашкуСеменапомещаютсянакрываютсябумагойвиоставляются на несколько дней. Затем биолог осторожно отрезаетбритвой кончик корня, в котором содержится бесценный материалДНК. На стекло, куда нанесли уксусную кислоту, выкладывается99Hieróchloë от греч. Ἱερός ниспосланный богами, угодныйбожественный.100Anthoxánthum от греч.аnthos — цветок и xanthos — жѐлтый.101кумарин активно используется в косметологиибогам,священный,79отрезанный кончик и накрывается покровным стеклом.
Кислотадолжна разрушить стенки клетки, а зажимание стеклами позволитбиологу увидеть хромосомы на плоскости. После этого «препарат» ввидедвухстеклянныхпластиноксзажатыммеждунимибиологическим материалом помещают в холодильник на сутки, либозаливают жидким азотом. Заморозка необходима для того, чтобыпревратить «препарат» в «постоянный»: что означает, что послезаморозки с ним можно будет работать в течение долгого времени,делать перерыв и возвращаться, и материал не будет разрушаться.После заморозки биолог аккуратно, чтобы не повредитьхромосомы, снимает покровное стекло. Второй этап работы гибридизация.
FISH — флюоресцентная гибридизация in situ — этометод, который применяют для выявления и определения положенияспецифической последовательности ДНК на хромосомах. Биолог спомощьюмикроскопа осматривает материалиищетклетки,находящиеся в стадии деления. Во время деления клетки хромосомыразделяются, создаются одиночные последовательности.
Хромосомыокрашиваются с помощью добавления специального вещества (частоиспользуется фосфор). Далее добавляется «зонд» - меченая ДНКдругого вида растения. Если в структурах ДНК двух разных видовестьодинаковыепоследовательности,тоодинарныецепочкисоединяются, и с помощью флюоресцентного микроскопа можноувидеть, как меченая другим цветом «чужая» ДНК «схлопнулась» сДНК изучаемого вида. На этом этапе исследователь может сделатьвывод о том, родственны ли в принципе данные растения.
Болеетонкие виды анализа призваны показать, сколько и какие сходныепоследовательности содержат ДНК.Даже этот, считающийся самым простым, метод на каждом изэтапов грозит провалом исследованию. Вернемся к примеру сизучением общего происхождения зубровки и душистого колоска.Когда биолог начал свое исследование, ему нужно было сохранить80материал, часть корня, между двух стекол в течение строгоопределенного срока притемпературе- 80 градусов. Но влаборатории не было специального промышленного холодильника, абытовой холодильник не создал условия для долгого храненияматериала. Не было средств и на покупку жидкого азота.
В итогечасть материала была утеряна на том этапе, когда нужно было снятьпокровное стекло. Клеточные структуры были разрушены. В условияхпотерь было необходимо большое количество исследуемого. Однакобиолог не смог получить нужное количество из экспедиции.Экспедиции проводятся, как правило, не чаще одного раза в год,материалы редкие и собираются в ограниченных количествах.Кроме того, результаты «схлопывания» хромосом могут бытьзафиксированы только с помощью определенного вида приборов —микроскопа с ртутной лампой.
К этому же микроскопу необходимспециальный фото-прибор, создающий визуализацию происходящегопроцесса. Цветная фотография, где красным отмечены «чужие гены»,а синим - «свои», является доказательством утверждения ученого оналичии либо отсутствии родственных связей. В результате проводитьисследованиесталоневозможно.Биологизменилобъектисследования: взял два вида рода anthoxanthum и стал выявлятьродство. Смена объекта оказалась рациональным шагом в преддвериискорой защиты, но лишила работу новизны.Дальше мы кратко рассмотрим еще два метода, применяемыхсотрудниками лаборатории.- Метод ПЦРПолимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод, позволяющийдобиться увеличения малых концентраций определѐнных фрагментовДНК в пробе.
Помимо увеличения числа копий ДНК, ПЦР позволяетпроизводить множество других манипуляций с нуклеиновымикислотами и широко используется в биологической и медицинской81практике, например, в диагностике заболеваний и приустановленияотцовства. В лаборатории биосистематики и цитологии ПЦРиспользуется для выявления общих участков ДНК в исследуемыхрастениях. Суть метода в том, чтобы с помощью специальногоферментаДНК-полимеразысоздатьбольшоечислокопийопределенного участка ДНК. Также как и в предыдущем методе,участок «чужой» ДНК «садится» на исследуемую ДНК, если у нихесть общие последовательности белков.
Для проведения ПЦРтребуются следующие компоненты:1.ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, которыйтребуется амплифицировать (прим.: умножить, сделать много копий)2.два праймера (участки «чужой» ДНК) соответствующиепротивоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК3.Термоустойчивая ДНК-полимераза — фермент, которыйкатализирует реакцию4.Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).5.Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.6.Буферныйраствор,обеспечивающийнеобходимыеусловия реакции — рН, ионную силу раствора.
Содержит соли, бычийсывороточный альбумин.7.Чтобыизбежатьиспаренияреакционнойсмеси,впробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое.Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этогоделать не требуется.Первый описанный нами метод позволяет выяснить, есть ли, впринципе, общие последовательности в ДНК двух видов растений.Второй метод позволяет выделить конкретный участок, которыйявляется общим и клонировать его, чтобы с помощью других методованализа уточнить количество общих комбинаций белков. Метод ПЦР82дополняет предыдущий, но является более тонким в исполнении иболее дорогостоящим, так как вместо микроскопа и глаз ученогоработу по определению сходных участков в ДНК выполняет прибор.- Метод электрофорезЭлектрофорез в полиакриламидном геле102 в молекулярнойбиологии и биохимии – это метод, используемый для разделениябелков и нуклеиновых кислот.
Его действие основано на движениизаряженных молекул в постоянном электрическом поле. Разделение вгеле происходит за счѐт различий заряда молекул и отличиймолекулярных масс. Электрофорез (илипросто «форез» как егоназывают а лаборатории) можно описать как метод визуализациирезультатов ПЦР. Если ПЦР производится для того, чтобыопределить, существуют ли в ДНК схожие последовательности, тофорез позволяет увидеть, каков процент этих последовательностей.Что нужно для проведения фореза? Во-первых, специальный прибор,который представляет собой пластиковый контейнер, к одной изстенок которого подведен ток. Материал ДНК смешивается соспециальным гелем и подогревается, затем подогретым гелемзаполняется контейнер.
После застывания геля пускается ток, ичастицы ДНК начинают двигаться. Там, где след в геле более темный,присутствуют схожие последовательности ДНК. Разметка на стенкахконтейнера также позволяет сделать выводы о массе веществ.- Метод секвенированиеСеквенирование белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК —представляет собой определение их первичной аминокислотной илинуклеиновойпоследовательности.Врезультатеполучаетсясимвольное описание, которое сжато резюмирует атомную структурумолекулы. Другими словами, если в процессе ПЦР-реакции, было102сокр. электрофорез в ПААГ, ПААГ электрофорез; англ.
PAGE, Polyacrylamide GelElectrophoresis.83выявлено, что в ДНК двух видов растений есть некие сходныепоследовательности, и повторяющийся участок был клонированнесколько раз, секвенирование позволяет выявить, какие именнопоследовательности совпадают. Известно, что комбинация ДНКнеповторима, как отпечатки пальцев. Таким образом, цель всейдлительной цепочки описанных выше процедур — получитьуникальный код, который будет характеризовать данный видрастений103. Коды с помощью компьютерных программ вводятся вспециальные общероссийские и общемировые базы данных. Работа сгенбанком делает возможным проведение исследования с редкимиматериалами, эти базы доступны ученым со всего мира104.2.3. Свои и чужие: выстраивание коллектива лабораторииЛаборатория биосистематики и цитологии, в соответствии сосвоим официальным двойным названием, включает два помещения:«биосистематику» и «молекулярку».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
