Диссертация (1097599), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Скорости реакцийфосфорилирования Vp,i(Si,Sj,pi) и дефосфорилирования Vd,i(pSi,Sk,pi) сигнальныхбелков описываются в рамках метода ферментативной кинетики. Система ОДУ(2.1)-(2.2) содержит 32 уравнения и 53 кинетических параметра: скоростипрямых ki и обратных k-i реакций образования рецепторных комплексов икинетические параметры отдельных ферментов pi. Полная система кинетическихуравнений модели приведена в работе [17] из списка опубликованных работ.Изложим основные процессы и реакции, учтенные в модели (2.1), (2.2)сигнальных систем. Модель включает в себя следующие подсистемы: Модель комбинационной активации ErbB1-4 рецепторной системы Модель интерфейса между рецепторной системой и системой передачисигналов Модель PI3K/PTEN/AKT сигнального пути Модель RAS/MEK/ERK сигнального пути Модель mTOR1/S6K1/4EBP1 сигнального путиМодель рецепторной подсистемы описывает инициализацию передачиклеточных сигналов в результате активации клеточных рецепторов при ихсвязыванииссоответствующимилигандами.Вмоделирассмотренаинициализация рецепторных сигналов в результате активации семействаклеточных рецепторов эпидермального факторов роста: ErbB1 (EGFR, HER1),ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3) и ErbB4 (HER4).
При связывании рецепторов слигандами происходит гетеродимеризация и гомодимеризация рецепторов собразование активных рецепторных комплексов. Благодаря тирозинкиназнойактивностицитоплазматическихдоменоврецепторовпроисходитавто-фосфорилирование тирозиновых остатков в димерных рецепторных комплексах.В модели кинетики клеточных рецепторов учтены ингибиторы трастузумаб ипертузумаба, которые, связываясь с рецептором ErbB2, ингибируют образование32Рис. 2-1. Схема модели RAS/MEK/ERK и PI3K/AKT/mTOR/S6K1сигнальных путей, активируемых HER2 и HER3 рецепторами.Пунктирными линиями показаны отрицательные обратные связи,учтенные в модели.
Показаны ингибиторы, исследованные в модели:ингибитор HER2 рецепторов, пертузумаб (2С4 моноклональноеантитело); ингибитор киназы PI3K, LY294002; ингибитор киназыmTOR1рапамицинипрепаратдвойногодействия,BEZ235,ингибирующий PI3K и mTOR1,2 киназы.комплексов ErbB2/ErbB2 (трастузумаб) и ErbB2/ErbB3 (трастузумаб),соответственно.
Подробное обсуждение модели кинетики активации рецепторов33обсуждается в разделе 2.1.1.Модельвключаетдвесигнальныесистемы:RAS/MEK/ERKиPI3K/PTENAKT/mTOR, которые осуществляют передачу сигналов клеточнойпролиферации и дифференцирования от рецепторной подсистемы в клеточноеядро и другие сигнальные системы (см.
Рис. 2-1). Связь между рецепторной исигнальной системами реализуется за счет белков-адаптеров, которые образуютинтерфейс между двумя указанными системами. Белки-адаптеры связываются сфосфорилированными тирозиновыми остатками клеточных рецепторов иявляются местами связывания и активации протеин-киназ на начальных стадияхактивации RAS/MEK/ERK и PI3K/PTENAKT/mTOR сигнальных систем. Кбелкам-адаптерам относятся следующие белки: Sch, Grb2, Grb10, Gab1 (Lemmon& Schlessinger, 2010). В модели учтено, что активация Ras киназы происходит врезультате связывания Grb2 белка-адаптера с SOS белком, который являетсябелковымфакторомобменагуаниннуклеотидовGDP/GTP(RasGEF).Связывание цитоплазматического белка SOS с мембранным рецепторомявляется процессом инициализации передачи сигнала в RAS/MEK/ERKсигнальной системе.В модели инициализации PI3K/PTENAKT/mTOR сигнальнойсистемыпроисходит в результате связывания PI3-киназы (p85 регуляторной субъединицыPI3K) непосредственно с фосфотирозиновым остатком ErbB рецепторов, либо сбелками-адаптерами Grb2 и GAB1.
Активация PI3K происходит в результатефосфорилирование p85 сигнальной субъединицы PI3-киназы, что приводит ксинтезу фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (PIP3) при фосфорилированиифосфатидилинозитол-4,5-дифосфата(PIP2).Вмоделиучтенареакциядефосфорилирования PIP3 фосфатазой PTEN, которая вместе с киназой PI3Kконтролирует баланс сигнального липида PIP3 в процессе передачи клеточныхсигналов. В модели учтено также, что фосфатаза PTEN обладает как липидной,так и белковой фосфатазной активностями, а также подвергается пост-34трансляционной модификации за счет ее фосфорилирования киназами GSK3 иCK2, что приводит к инактивации PTEN.Генерация PIP3 на внутренней поверхности клеточной мембраны приводитк связыванию многих цитоплазматических белков с мембраной с последующейих активацией и образованием мембранных белок-белковых и белокрецепторных сигнальных комплексов.
В модели учтено связывание PIP3 спротеинкиназой В (AKT), фосфоинозитол-зависимыми киназами PDK1 иmTOR2, что приводит к их закреплению на плазматической мембране. КиназыPDK1иmTOR2активируютпротеин-киназуAKTврезультатефосфорилирования AKT(Thr308) и AKT(Ser473), соответственно. В моделиполностью активированная протеин-киназа AKT (ppAKT(Thr308, Ser473))диссоциирует от клеточной мембраныи мигрирует в цитоплазму, гдеактивирует множество сигнальных путей. Активация AKT являются выходнымсигналом системы и зависимости концентрации рAKT от времени сравниваласьв работе с экспериментальными данными для выбора параметров модели, прикоторыхтеоретическаямодельнаилучшимобразомописываетэкспериментальных данных.Модель также описывает активацию RAS/MEK/ERK сигнального пути.
Какбыло уже сказано, связывание цитоплазматического белка SOS с мембраннымрецепторомявляетсяпроцессоминициализациипередачисигналавRAS/MEK/ERK сигнальной системе. SOS является белковым фактором обменагуанин нуклеотида RasGEF для Ras киназы, которая связывается с клеточноймембраной посредством гидрофобного остатка фарнезила, в результате чегопроисходит образование активного комплекса RasGTP.
В модели учтен белокактивации GTPase, RasGAP, который переводит Ras в неактивную формуRasGDP. Далее в модели учтено, что активированная форма RasGTPфосфорилирует Raf киназу, которая в свою очередь фосфорилирует два фосфосайта MEK киназы MEK(Ser217/221). Фосфатаза PPA2 дефосфорилирует ppMEK35(Ser217/221).АктивнаяERK(Thr202,Tyr204).MEKФосфатазакиназаDUSPфосфорилируетERKдефосфорилируеткиназуppERK(Thr202,Tyr204).В модели также рассмотрен один из сигнальных путей, активируемыйпротеин-киназой AKT, который является эффективной мишенью лекарственнойонкотерапии (Efeyan & Sabatini, 2010): каскад реакций активации киназногокомплекса mTOR1. В модель включен следующий механизм регуляция mTOR1комплекса. AKT фосфорилирует TSC1/2 комплекс, который является GTPaseактивирующим белком (GAP) Rheb киназы (Inoki, Li, Xu, & Guan, 2003).Фосфорилирование TSC1/2 приводит к инактивации гидролазной активностиTSC1/2 комплекса (за счет его связывание с 14-3-3 белком) и накоплению киназыRheb в активном состоянии Rheb(GTP).
В модели принят один из обсуждаемыхв литературе механизмов активации mTOR1 комплекса: фосфорилированиеmTOR1(Ser2448) Rheb(GTP) киназой (Memmott & Dennis, 2009). СубстратамиpmTOR1(Ser2448) являются S6 киназа и eIF4E связанный белок, 4EBP1,ингибирующий кэп-зависимую трансляцию. Фосфорилирование S6K и 4EBP1киназ приводит к инициализации трансляции и росту клеток. В моделирассмотрены следующие ЛП, ингибиторы mTOR1 комплекса: рапамицин,аллостерический ингибитор и BEZ235, ATP-конкурентный ингибитор. Действиеэтих ЛП на mTOR1/S6K/4EBP1 сигнальный путь синтеза белка подробнорассматривается в главе 6.С целью определения кинетических параметров модели был развит методкалибровки модели по кинетическим данным, полученных в различного типаэкспериментах.
Для этого был разработан план экспериментов по кинетикеактивации и ингибированию PI3K/PTEN/AKT и RAS/MEK/ERK сигнальныхпутей линии раковых клеток яичников PE04. В экспериментах, выполненныхколлабораторами проекта в Центре Исследования Рака ЭдинбургскогоУниверситета,былаизмеренакинетикафосфорилированияосновных36сигнальных белков после добавления в популяцию клеток 1 нМ HRG1-вотсутствии и присутствии ингибитора. Кинетические параметры моделиопределялись на основе наилучшего согласия расчетных и экспериментальныхкинетических кривых с использованием вычислительных методов минимизациидля квадратичного отклонения.
Для ряда известных кинетических параметровреакций образования молекулярных комплексов и реакций фосфорилированиябелков были использованы литературные данные. Особое внимание в этомметоде уделяется надежному определению кинетических параметров белков,которые являются мишенями ЛП. С этой целью был разработан методопределения кинетических параметров отдельных сигнальных белков и ихвзаимодействия с ингибиторами на основе наборов in vitro данных, полученныхв различных экспериментальных условиях. Описание метода приведено вразделе 2.3.2.2. Комбинационнаяактивациясистемыклеточныхрецепторовэпидермального фактора роста ErbBВ кинетической модели рецепторной системы была рассмотрена кинетикаактивации системы рецепторов эпидермального фактора роста ErbB и ихингибирование в результате действия ЛП пертузумаба и трастузумабаотдельности и в комбинации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
