Диссертация (1097599), страница 7
Текст из файла (страница 7)
В модели учтена реакция гетеродимеризацииErbB2/ErbB3 рецепторов, индуцированная связыванием лиганда нерегулина(HRG) с ErbB3 рецептором. На основе многочисленных исследований считается,что активация комплекс ErbB2/ErbB3 рецепторов приводит к активациимитогенного сигнала ответственного за рост многих типов раковых опухолей(Flågeng, Knappskog, Haynes, Lønning, & Mellgren, 2013; Lee-Hoeflich et al., 2008;Nagumo et al., 2009).37На Рис. 2-2 приведена общая схема реакций активации и ингибированиясистемы рецепторов эпидермального фактора роста, рассмотренных в модели.Лиганд HRG связывается с доменами I и III рецептора ErbB3 и вызываетконформационные изменения рецептора из неактивного состояния в активное, вчастности, конформация домена II становиться «открытой» (Landgraf, 2007). Этаконформация рецептора приводит к димеризации и стабилизации комплексаErbB2/ErbB3 за счет взаимодействия доменов II в ErbB2 и ErbB3 рецепторах.Рис.
2-2. Схема модели рецепторной системы. Кинетика лигандзависимой и независимой гомо- и гетеродимеризации ErbB3 и ErbB2рецепторов в отсутствии и присутствии лекарственных препаратовпертузумабаитрастузумаба.Вставка(А)показываетконформационное изменение ErbB3 рецептора при его связывании слигандом HRG. Вставка (B) показывает димерные комплексы, которыеблокируются этими лекарственными препаратами.38В противоположность рецепторам ErbB3, рецептор ErbB2 имеет всевнеклеточные домены в «открытых» конформациях, что, как предполагается,определяет его неконтролируемую гомодимеризацию и активацию сигнальныхпутей. Также предполагается, что транмембранный домен ErbB2 также даетвклад в гомодимеризацию и активацию ErbB2 рецепторов, не требующуювзаимодействия с лигандом (Landgraf, 2007).
В модели рассмотрена лиганднезависимая гомодимеризация ErbB2 рецепторов при его повышеннойэкспрессии в раковых клетках. Подробно моделирование этого механизмапроведено в главе 5.Формирование ErbB2/ErbB2 гомодимеров и ErbB2/ErbB3 гетеродимеровприводит к активности рецепторных тирозин киназ (RTK) и транс и автофосфорилированию тирозиновых остатков на цитозольных доменах рецепторов.В модели предполагается, что при повышенной экспрессии ErbB2 рецепторов враковых клетках активация ErbB2 рецепторов может происходить за счет каклиганд-независимого, так и лиганд-зависимого механизма, в частности, черезсвязывание с ErbB3 рецептором.При повышенной экспрессии ErbB2 рецепторов (при амплификации ErbB2гена) активация рецепторных тирозин-киназ идет, главным образом, по лиганднезависимому механизму активации за счет ErbB2 гомодимеризации.
Принормальной экспрессии ErbB2 рецепторов ErbB2 связывается с другимирецепторами ErbB семейства за счет лиганд-зависимого механизма, в частности,через связывание с ErbB3 рецептором.39Рис. 2-3. Схема структуры вне- и внутриклеточного доменов ErbB2 иErbB3 рецепторов. Показаны сайты связывания рецепторов междусобой, пертузумаба и трастузумаба, а также фосфо-тирозин-остаткисвязывания с белком адаптером Grb2 и p85 регуляторной субъединицейPI3 киназы.Тирозин-фосфорилилованныесайтырецепторовявляютсяместамисвязывания и активации различных белков-адаптеров, которые связываютсигнальныебелкиначальнойстадииактивацииPI3K/PTEN/AKTиRAS/MEK/ERK сигнальных путей (Schulze et al., 2005).
На Рис. 2-3 показанысхемы ErbB2 и ErbB2 рецепторов с тирозиновыми остатками внутриклеточныхдоменов, являющиеся местами связывания для белком адаптером и сигнальныхбелков. В модели учтено, что ErbB2 и ErbB3 по-разному взаимодействуют ссигнальными белками и могут по-разному активировать PI3K/PTEN/AKT иRAS/MEK/ERK сигнальные пути. ErbB2 рецептор имеет несколько сайтоввзаимодействия с белками адаптерами Shc и Grb2, которые связывают SOS белоки активизирует RAS/MEK/ERK сигнальный путь.
Как видно, ErbB2 рецептор неимеет мест связывания для p85 регуляторной единицы PI3 киназы, котораяактивирует PI3K/PTEN/AKT сигнальный путь. Рецептор ErbB3 имеет местасвязывания как для белков адаптеров Shc и Grb2, так и PI3 киназы, что приводитк активации как PI3K/PTEN/AKT, так и RAS/MEK/ERK сигнальных путей40одновременно (Schulze et al., 2005).
Таким образом, в модели предполагается, чтообразование гомодимерных комплексов ErbB2/ErbB2 приводит к, главнымобразом, к активации RAS/MEK/ERK сигнальных путей, в то время какгетеродимерные комплексы ErbB2/ErbB3 активируют как RAS/MEK/ERK, так иPI3K/PTEN/AKT сигнальные пути. Отметим, что в модели не учитываетсявозможность активации PI3 киназы комплексом ErbB2/ErbB2 за счетобразования белковых комплексов Grb2-GAB1-PI3K (Yarden & Sliwkowski,2001). Сделанное предположение и его следствия, полученные в результатемоделирования были проверены на экспериментальных данных. Было показано,что комплексы ErbB2/ErbB3 являются наиболее сильными активаторамиPI3K/PTEN/AKT сигнальные пути за сет прямого связывания PI3K с фосфотирозиновыми остатками ErbB3 рецептора как при высокой, так и принормальной экспрессии ErbB2 рецепторов в раковых клетках (Choi, Fan, Deng,Zhang, & An, 2012). Активация гомодимерных ErbB2 комплексов приводит,главным образом, к активации RAS/MEK/ERK сигнального пути.Таким образом, в модели учтено, что, несмотря на то, что трастузумаб ипертузумаб связываются с одним и тем же рецептором ErbB2, они оказываютразличные ингибирующие действие на RAS/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKTсигнальные пути за счет различных эффектов на кинетику гомо- игетеродимеризации ErbB2 и ErbB3 рецепторов.
Этот приводит к тому, чторазличный уровень экспрессии ErbB2 и ErbB3 рецепторов в различных линияхраковыхклетках,рецепторныхопределяющийкомплексов,балансвызываетErbB2/ErbB3различныйиуровеньErbB2/ErbB2активацииRAS/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальных путей. Отметим, сто различныеэффекты трастузумаба и пертузумаба на ингибирование кинетики рецепторовопределяются различием взаимодействия этих моноклональных антител сErbB2: трастузумам связывается с IV внеклеточным доменом рецептора (Cho et41al., 2003), в то время как пертузумаб взаимодействует с I доменом (Franklin et al.,2004) (Рис. 2-2).Таблица 2-1.
Ингибирующий эффект трастузумаба и пертузумаба на кинетикугомо- и гетеро-димеризации ErbB2 и ErbB3 рецепторов в присутствии иотсутствии лигандов ErbB3 рецептора.ЛПТрастузумабРецептор1ErbB2ТрастузумабErbB2Трастузумабp95ErbB2ТрастузумабErbB2ПертузумабErbB2ПертузумабErbB2ПертузумабErbB2Рецептор ЛигандИнгибирующий2эффектErbB3+слабый (Austin et al.,2004)ErbB3+(Junttila et al.,2009)+(Molina et al.,2001)ErbB2+(Ghosh et al.,2011)ErbB3++(Agus et al.,2002)ErbB3слабый (Junttila et al.,2009)ErbB2(Ghosh et al.,2011)Для описания ингибирующих эффектов пертузумаба и трастузумаба наактивацию рецепторов в модели были учтены следующие экспериментальныеданные. Пертузумаб эффективно ингибирует кинетику лиганд-зависимогообразования гетеродимеров ErbB2/ErbB3, в то время как трастузумаб неблокирует гетеродимеризацию ErbB2 с ErbB1 (EGFR) и с ErbB3 (Junttila et al.,2009), (Austin et al., 2004).
При отсутствии рецепторных лигандов, эффект этихЛП – обратный: пертузумаб не ингибирует, а трастузумаб ингибируетобразование гетеродимеров ErbB2/ErbB3 (Junttila et al., 2009), (Austin et al., 2004).Трастузумаб эффективно ингибирует формирование гомодимеров ErbB2/ErbB2и не способен ингибировать лиганд-зависимое образование гетеродимеров42ErbB2/ErbB3 (Ghosh et al., 2011). В модели также рассмотрена возможностьсвязывания комбинации трастузумаба и пертузумаба с ErbB2 рецептором, чтоприводит к блокировке формирования ErbB2/ErbB2 гомодимеров (Fuentes,Scaltriti, Baselga, & Verma, 2011).
Приведенные выше эффекты трастузумаба ипертузумаба на ингибирование кинетики рецепторов кратко представлены вТаблице 2-1.В модели рассматривается как лиганд-зависимая, так и лиганд-независимаякинетикаактивациирецепторнойсистемы.Модельучитываетэкспериментальные данные, указывающие на преобладание лиганд-независимойкинетикаформированиякомплексовиErbB2/ErbB3ErbB2/ErbB2приповышенной экспрессии ErbB2 рецепторов в раковых клетках (Garrett, Sutton,Kuba, Cook, & Arteaga, 2013; Junttila et al., 2009).
При нормальной экспрессиирецепторов образование лиганд-зависимых комплексов ErbB2/ErbB3 идет болееинтенсивно, и они являются более стабильными, чемлиганд-независимыекомплексы ErbB2/ErbB3 (Junttila et al., 2009). В модели рецепторной системы неучитываетсяэкспрессия«укороченного»ErbB2рецептора,p95ErbB2,являющегося активной формой рецептора (Molina et al., 2001; Sims et al., 2012) ине учитывается его ингибирование трастузумабом.Модель кинетики активации системы ErbB рецепторов используется вполной модели RAS/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальных путей иприменяется к исследованию эффективности ингибирующего действия ЛП,ингибиторов рецепторов трастузумабом и петрузумабом, а также ингибиторовпротеин-киназ, LY294002 и BEZ235 для пяти линиях раковых клеток яичников сразличным уровнем экспрессии ErbB1-4 рецепторов и с различным наборомонкомутаций в PI3K/PTEN/AKT и RAS/MEK/ERK сигнальных путях В Таблицах2-2 и 2-3 приведены данные о мутациях и уровнях экспрессии ErbB1-4рецепторов в исследуемых клетках.43Таблица 2-2.
Мутаций в RAS/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальных путях вклеточных линиях рака яичников (https://cansar.icr.ac.uk/cansar/cell-lines/A2780/mutations/)Клеточная линияМутацииА2780PTEN (p. k128_R130del)SKOV3PIK3CA (c.3140A>G)TP53 (c.267delC)OVCAR3TP53 (c.743G>T)TOV21GPIK3CA (c.3139C>T)KRAS (c.37G>T)PTEN (p. 425delG), (c.795delA)Дикий типPE04Таблица 2-3. Уровни экспрессии ErbB рецепторов в клеточных линиях ракаяичников (Gilmor et al. 2001; Prasasya et al 2013).КлеточнаяErbB1ErbB2ErbB3ErbB4PE04низкийсреднийсреднийвысокийА2780-низкийсреднийсреднийSKOV3-высокийсреднийнизкийTOV21Gнизкийсреднийнизкийнизкийлиния442.3. Моделирование функционирования сигнальных белков и действияингибиторовС целью детального описания кинетики сигнальных белков и ихвзаимодействияслекарственнымипрепаратамибылпримененметодмоделирования ферментативного катализа на основе in vitro экспериментальныхданных, полученных в различных экспериментальных условиях.
Схема методаприведена на Рис. 2-4. Для разработки кинетических моделей сигнальныхбелков, их калибровки и валидации в методе используются два типаэкспериментальных данных: зависимости активности киназ от концентрациисубстратов, измеренных в отсутствии и присутствии ингибиторов и дозовыезависимости активности ферментов от концентрации ингибиторов.Данныйметод позволяет интегрировать экспериментальные данные, полученные вразличных экспериментальных условиях, с целью повышения точностиопределения кинетических параметров ферментов и их ингибиторов за счетиспользования расширенного набора экспериментальных точек (CornishBowden, 2014). Также при разработке моделей принимается во вниманиеэкспериментальные данные по молекулярной структуре фермент-субстратного ифермент-ингибиторногокомплексов,чтопозволяетдискриминироватьразличные механизмы катализа и действия ингибиторов на этапе разработкикинетических моделей. В данном методе оценка надежности разработанныхмоделей осуществляется путем проверки предсказательных способностеймоделей на основе экспериментальных данных, не использованных приразработке моделей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
