Диссертация (1097599), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Близость значенийIC50 для рапамицина IC50=9.6 nM (+FKBP12) и IC50>1 M (без FKBP12) с60константами диссоциации ,2 =6 nM (3.1; 6.9) (+FKBP12) и ,1 =1.7 μM(1.3; 1.8) (без FKBP12) подтверждает полученное соотношение (2.10).Таким образом, если в эксперименте на клеточной популяции полученосущественное отличие значения IC50 от значения константы диссоциации дляаллостерическогоингибитора,то,вероятнеевсего,подавлениеегоингибирующей способности связано с мутациями в сигнальной системе. Вслучае ATP-конкурентного ингибитора это различие может быть также связанос зависимостью IC50 от ATP концентрации согласно ур. (2.9).Для определения кинетических параметров скорости реакции VS6K1фосфорилированияS6K1киназы(ур.(2.8))былииспользованыэкспериментальные данные по зависимости скорости реакции от ATPконцентрации при различных концентрациях ингибитора LY294002 (Toral-Barzaet al., 2005).
Учитывая, что LY294002 является неспецифическим ингибиторомPI3K (Vlahos et al., 1994), а также то, что PI3K и mTOR киназы обладают высокойгомологичностью структур их каталитических сайтов, было предположено, чтомеханизм ингибирования mTOR киназы ингибитором LY294002 является такимже, как для PI3K киназы. Результаты фиттирования экспериментальных данныхи найденные кинетические параметры приведены на Рис.
2-10 и Таблице 2-5.Представление кинетических данных в форме графика Лайнвивера — Берка наРис. 2-10А подтверждают ATP-конкурентный механизм ингибирования mTORкиназы ингибитором LY294002. Таким образом, аналогично ингибиторуBEZ235, LY294002 является также ингибитором двойного действия для PI3K иmTOR киназ.С целью определения констант диссоциации рапамицина Kd,Rap1 и Kd,Rap2 сmTOR1 в отсутствии и присутствии FKBP12 белка были использованыэкспериментальные данны по дозовым зависимостям ингибирования реакциифосфорилирования S6K1(Thr389) ингибитором рапамицином (Toral-Barza et al.,2005). При фиттировании были получены следующие константы диссоциаций61Kd,Rap1=1.7 μM (1.3; 1.8) и Kd,Rap2=1.6 nM (1.2; 1.7) в отсутствии и приисутствииFKBP12 белка, соответственно (линии 1 и 2 на Рис.
2-12B). СравнениеТаблица 2-5. Кинетические параметры mTOR1 киназы и ее ингибиторов,рапамицина, BEZ235 и LY294002. Указаны значения медиан и в скобкахприведены доверительные интервалы, полученные методом бутстрапинга.Приведены также экспериментальные данные, полученные на очищенномферменте. Km и Ki константы Михаелиса и ингибирования.Кинетические параметрыЭкспериментальные значенияКонстанта скорости реакции, k4EBP10.47 min-1 (0.41; 0.48)0.47 min-1 (Tao et al., 2010)Константа диссоциации ATP, Kd,ATP8.4 μM (6.2; 8.9)Km= 74 μM (Tao et al., 2010)Константа диссоциации 4EBP1,Kd,4EBP111.1 μM (7.8; 11.8)Km=9.5 μM (Tao et al., 2010)Константа диссоциации S6K1, Kd,S6K10.42 μM (10-3; 0.5)Km=0.8 μM (Tao et al., 2010)Коэффициент ингибирования скорости реакции mTOR для субстрата4EBP1 ингибитором рапамицином, ηRap0.43 (0.38; 0.44)Константа диссоциации рапамицина, Kd,Rap11.7 μM (1.3; 1.8); -FKBP12 и +S6K1IC50> 1 μM (Toral-Barza et al., 2005)Kd=490±39 nM1), FPA (Banaszynski et al.,2005)Kd=26 ± 0.8 nM1), SPR (Banaszynski et al.,2005)Константа диссоциации рапамицина, Kd,Rap26 nM (3.1; 6.9); +FKBP12 и +4EBP1IC50=9.6 nM (Tao et al., 2010)Kd=0.35 nM2), FPA (Banaszynski et al.,2005)Kd=12±4.2 nM2), SPR (Banaszynski et al.,2005)Kd=3 nM2) (Chen et al., 1995)1.6 nM (1.2; 1.7); +FKBP12 и +S6K1IC50=2 nM (Toral-Barza et al., 2005)Константа диссоциации BEZ235, Kd,BEZ0.56 nM (0.48; 0.57)Ki =2.5 nM, 1.7 nM (Tao et al., 2010)IC50=10 nM (Tao et al., 2010)62Константа диссоциации LY294002, Kd,LY0.12 μM (0.09; 0.13)IC50=1.5 μM (Tao et al., 2010)1)Экспериментальные константы диссоциации, полученные в отсутствииFKBP12 белка методом флуоресцентной поляризационной спектроскопии (FPA)и методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR).2)Экспериментальные константы диссоциации получены в присутствииFKBP12 белка.полученных констант показывает, что присутствие FKBP12 белка существенноувеличивает сродство рапамицина к mTOR киназе.
Также полученная константадиссоциации в присутствии FKBP12 белка Kd,Rap2=1.6 nM (1.2; 1.7) согласуется сэкспериментальными значениями 0.35 нM и 12±0.8 нM, полученными методамиполяризационно-флуоресцентной спектроскопии и поверхностно-плазмонногорезонанса, соответственно (Banaszynski et al., 2005).
Для константы диссоциациив отсутствии FKBP12 белка экспериментальные значения, полученныеуказанными методами, находятся в микромольном диапазоне 490±39 нM и26±0.8 нM (Banaszynski et al., 2005). Отметим, что значения константдиссоциации рапамицина,полученные в модели и эксперименте, близки кзначению IC50=2 nM в присутствии FKBP12 белка и IC50> 1 μM в его отсутствии(Toral-Barza et al., 2005). Близость значений констант диссоциации и IC50 дляингибитора рапамицина подтверждает соотношение равенства Kd и IC50 (ур.(2.10)) для аллостерических ингибиторов.Для валидации модели mTOR1 киназы (ур.
(2.7) был выполнен расчетдозовойзависимостиингибиторомингибированияLY294002(Рис.S6K1(Thr389)2-10С)ифосфорилированияпроведеносравнениесэкспериментальными данными (Toral-Barza et al., 2005). По аналогии с ур. (2.),зависимость значения IC50 для LY294002 от концентрации ATP даетсяуравнением50 = , (1 +),,(2.11)63которое позволяет рассчитывать LY294002 IC50 значения при различныхконцентрациях ATP.
При концентрации ATP 100 μM, использованной вэксперименте (Toral-Barza et al., 2005) ур. (2.11) дает значение IC50=1.5 μM, чтосоответствует экспериментальной величине, определенной в этом эксперименте(см. экспериментальные данные на Рис. 2-10С).Таким образом надежноеопределение параметров ур. (2.7), , и , , позволяет использовать этоуравнение для расчета значений IC50 для ингибитора LY294002 припроизвольных концентраций ATP как в in vitro экспериментах, так и вэкспериментах на клеточных популяциях.Уравнение (2.11) было использовано при сравнении расчетов дозовыхзависимостейингибированияmTOR1ингибиторомLY294002приконцентрациях ATP 2 μM и 100 μM (линии 1 и 2 на Рис.
2-10С). Так как LY294002является ATP-конкурентным ингибитором, значение IC50 уменьшается приуменьшении уровня ATP с IC50=1.5 μM при 100 μM ATP до IC50=0.15 μM при 2μM ATP. Таким образом, LY294002 становиться более сильным ингибиторомmTOR1 при низких концентрациях ATP, и его ингибирующая активностьстановиться ниже при повышении концентрациях ATP. Так при концентрацияхATP 5 мМ, характерной для внутриклеточной среды(McLaughlin, Wang,Gambhir, & Murray, 2002), ур. (2.11) дает значение IC50=71 μM.
Заметим, чтосогласно ур. (2.10) действие аллостерического ингибитора рапамицина независитотклеточнойконцентрацииATP.Этосогласуетсясэкспериментальными данными по IC50, полученными на клеточных популяциях.Полученная модель mTOR киназы была использована для исследованиядействия комбинации двух лекарств: аллостерического ингибитора рапамицинаи ATP-конкурентного ингибитора LY294002. Была рассчитана дозоваязависимость ингибирования активности mTOR1 от концентрации LY294002 приконцентрации рапамицина 10 нM и 100 μM ATP (линия 3 на Рис.
2-10С). Расчетпоказал аддитивный эффект двух ингибиторов и возрастание IC50 значения с 1.564μM до 30 μM. Этот результат указывает на отсутствие синергетического эффектарапамицина и LY294002 при их комбинации.2.3.3. Кинетическая модель PTEN фосфатазыДля определения параметров модели фосфатазы PTEN были использованыэкспериментальные кинетические данные, измеренные на униламелярныхсмешанных фосфатидилхолиновых везикулах, содержащих липидный субстратPIP3 (McConnachie, Pass, Walker, & Downes, 2003).В этом экспериментеобъемная концентрация PIP3 в везикулах варьировалась при фиксированнойповерхностной концентрации липида XPIP3 (мольная фракция). В результате,зависимость активности PTEN от объемной концентрации PIP3 была определенапри различных мольных фракциях XPIP3 на поверхности везикул.
Длямоделирования экспериментальных данных, полученных в работе (McConnachieet al., 2003), было использовано уравнение Михаелиса-Ментен для скоростиреакции ∙ ∙ 3(2.12)3 + 3и KPIP3 – константа каталитической скорости реакции и константа =где kPTENМихаэлиса.PIP3s= XPIP3PIP3.На Рис. 2-11 показаны результаты фиттирования зависимости скоростиреакции VPTEN (ур. (2.12)) от объемной концентрации PIP3 при четырехповерхностных концентрациях PIP3, XPIP3по экспериментальным данным(McConnachie et al., 2003). Представление теоретических и экспериментальныхданных в обратных координатах 1/PIP3 и 1/VPTEN показывает, что уравнениескорости реакции (2-4) удовлетворительно описывает скорость реакции приразличных значениях XPIP3.
Более того, прямые линии, соответствующие65различным фракциям XPIP3, пересекаются в одной точке, что указывает нанезависимость максимальной скорости реакции от поверхностной концентрацииXPIP3. Полученный набор кинетических констант PTEN приведен в Таблице 2-6.Рис.2-11. Зависимость скорости реакции PTEN от PIP3 различныхконцентрациях поверхностной фрации PIP3 в визикулах XPIP3.Зависимость дана в обратных координатах 1/VPTEN и 1/PIP3. Линиитеоретические результаты, точки- эксперименталььные данные поPTEN гидролазной активности в фосфатидилхолиновых везикулах приXPIP3=0.1 (темные кружки), 0.01 (светлые кружки), 0.002 (темныеквадраты), 0.001 (светлые квадраты) (McConnachie et al., 2003).Таблица 2-6.
Кинетические параметры PTEN фосфатазы. Указаны значениямедиан и в скобках приведены доверительные интервалы, полученные методомбутстрапинга. Приведены также экспериментальные данные, полученные наочищенном ферменте. Km и Ki константы Михаелиса и ингибирования.ПараметрkcЗначение48 min-1 (41; 49)Экспериментальные данныеkc =73±4.4 min-1 (McConnachie et al.,2003)kc =120 min-1 (Maehama et al., 2001)KPIP329 nM (20; 31)Km < 50 μM (Maehama et al., 2001)ikm=0.04±0.0051 (mol%) (McConnachie etal., 2003)KS =84±9.01 mM (McConnachie et al., 2003)1Параметры уравнения скорости (McConnachie et al., 2003) ∙ 3 ∙ 3 = ∙ + 3 ∙ ( + 3 )662.4.
Действие ингибиторов рецепторов эпидермального фактора ростана активацию PI3K/PTEN/AKT сигнальной системы в опухолевыхклеткахРазработанная модель PI3K/PTEN/AKT и RAS/RAF/ERK сигнальныхсистем была применена к исследованию действия лекарственных препаратов,ингибиторов рецепторов эпидермального фактора роста, на клеточные линиирака яичников с различным набором онкомутаций. Для определения полногонаборакинетическихспланированыпараметровэкспериментыподаннойсигнальнойизмерениюкинетикисистемыбылиактивациииингибирования PI3K/PTEN/AKT и RAS/RAF/ERK сигнальных систем вклеточных популяциях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
