Диссертация (1097599), страница 13
Текст из файла (страница 13)
При этом предполагается, что Cin,DSP = Cout,USP иCout_DSP = Cout (подсистемы не образуют ветвящихся процессов). Теоретически,функции откликов RSN, RUSP и RDSP могут быть рассчитаны на основе модели иизмерены экспериментально на основе двух дозовых зависимостей: дозовойзависимости RSN и дозовой зависимости активации/ингибирования рецепторов отконцентрациилигада/ингибитора=Cout(RUSP,PDSP,D2 ,t).RUSPнаосновесоотношенияRDSP823.3. Методыанализачувствительностисигнальныхсистемкпараметрам сигнальных белков и действию ингибиторовС целью исследования чувствительности сигнальных систем к действиюлекарственных препаратов и анализа лекарственной резистентности приразличных онкомутациях в опухолевых клетках в работе вводятся следующиепараметры чувствительности, резистентности и робастности сигнальных систем.Чувствительность PI3K/PTEN/AKT сигнальной системы к действиюингибиторов клеточных рецепторов определяется, как изменение выходногосигнала ∆ при изменении концентрации ингибитора ∆: (, 0 , , ) = |∆|∆Чувствительность (, 0 , , ) зависитот(3.1)каталитическихпараметровсигнальных белков , их концентрации 0 , концентрации ингибитора ивремени , при котором измерялся отклик системы.
Здесь и далее анализируютсяабсолютные значения чувствительности.С целью определения соотношения между чувствительностями полной,рецепторной и протеин-киназной системами был введен в рассмотрение сигналpErbB2, который является выходным сигналом рецепторной системы и входнымсигналом для протеин-киназной системы. С учетом этого чувствительность (, 0 , , ) может быть представлена в следующем виде (, 0 , , ) = |∆∆ ∆2|=||=∆∆2∆(3.2)= ( , ) ∙ ( , , ),где введена функции, описывающиея чувствительности рецепторной и протеинкиназной систем83∆2|∆∆ ( , ) = ||.∆2(3.3) ( , , ) = |(3.4)Функция описывает изменение рецепторного сигнала ∆2 приизменении концентрации ингибитора ∆, и функция определяет изменениевыходного сигнала ∆ при изменении входного сигнала ∆2.Таким образом, согласно соотношению (3-2), чувствительность полнойсистемы определяется чувствительностями ее подсистем и .
Этосоотношение в дальнейшем используется для анализа потери чувствительностисистемы к действию ЛП для рецепторной системы, а также к входному сигналуpErbB2 для протеин-киназной системы при изменениях параметров системы,вызванных мутациями генов, кодирующих сигнальные белки и рецепторысистемы.Для определения чувствительности сигнальной системы к параметрамсистемы были введены следующие функции, описывающие чувствительностирецепторной и протеин-киназной систем к изменению соответствующихпараметров (кинетических параметров сигнальных белков, рецепторов и ихконцентраций):, ( , , , ) = |∆2/2|∆ /, ( , , , ) = |(3.5)∆/|.∆ /Относительные чувствительности SRS,i и SPK,i (3.5) равны отношениямотносительногооткликасистемpErbB2/pErbB2иpAKT/pAKTкотносительному изменению параметров pi/pi, входящих либо в рецепторную,либо в протеин-киназную системы, соответственно.
В дальнейшем расчетыпроведены для 0.1% изменения параметров pi/pi .84С учетом введенных функций чувствительностей (3.5) можно определитьробастность сигнальной системы по отношению к набору параметров системы вданном диапазоне входного сигнала, если система сохраняет определеннуючувствительность к набору параметров системы { } в данном диапазоневходного сигнала (∆ или ∆)., ( , , , ) ≅ , ( , , , ) ≅ (3.6)∂2 ,, ( , , , ) =≅0∂ ∂(3.7)илиВведенные характеристики чувствительности системы используются вдальнейшем анализе чувствительности выходных характеристик сигнальныхсистем к действию ингибиторов и применяются к исследованию влиянияонкомутацийнаизменениечувствительностисигнальныхсистемклекарственным препаратам.3.4.
Анализ выходных характеристик системы клеточных рецепторовВ соответствии с методом декомпозиции сигнальной системы нарецепторную и протеин-киназную системы были исследованы выходныехарактеристики этих подсистем в отдельности. В данном разделе анализируютсявыходных характеристик рецепторной сигнальной системы. Разработаннаямодель сигнальных систем была применена к расчету дозовой зависимостиуровня фосфорилирования ErbB2 рецепторов от концентрации двух внешнихсигналов: лиганда (HRG) и ЛП пертузумаба (моноклонального антитела 2C4), атакже концентрации ErbB2 рецепторов в опухолевой клетке.85Результаты расчетов зависимостей уровня фосфорилированного рецептораpErbB2 от концентрации HRG, pErbB2(HRG) и пертузумаба pErbB2 (2C4)приведены на Рис. 3-2.
Дозовая зависимость pErbB2(HRG) имеет характерсигмоидной кривой с показателем Хилла n=2, что соответствует режиму«переключателя» в рецепторной системе: активация рецепторов от 10% до 100%происходит в узкой области концентраций HRG. Такое поведение коррелирует сэкспериментальными данными, которые показывают насыщение концентрацииактивированныхрецепторовpErbB2(HRG)при1нМHRG(см.экспериментальные данные на Рис. 3-2E). Значения EC50 для HRG былоопределено путем аппроксимации дозовой зависимости pErbB2(HRG) функциейХилла pErbB2(HRG)=HRGn/(HRGn+Kn), что дало значение EC50=3 nM близкое кэкспериментальному (Franklin et al., 2004).
Константа Хилла n=2, определённаяпри расчете, соответствует режиму переключения рецепторной системы в узкойобласти концентраций лиганда.Расчет дозовой зависимости для полной системы pAKT(HRG) показалтакже активацию в узком диапазоне концентраций HRG с насыщением приконцентрациях 0.06 нМ, что коррелирует с экспериментальной концентрациинасыщения HRG при 0.1 nM (Рис. 3-2E).Функция отклика рецепторной системы RSS, pErbB2(2C4), и полнойсигнальной системы SN, pAKT(2C4), от концентрации прертузумаба (2C4)приведена на Рис.
3-2В. Отличие между полученными функциями откликовопределяется функцией отклика протеин-киназной сигнальной системы STS,особенности которой будут обсуждаться в следующих разделах. На основе86Рис. 3-2. Функции отклика ErbB рецепторной системы. (А) Дозовыезависимости уровней pErbB2 (pERBB2) и pAKT от концентрациигерегулин- (HRG). Тонкой линией показана дозовая зависимостьpAKT(HRG) в присутствии ингибитора PTEN bpV(pic) (50 nM). (B)Дозовые зависимости pErbB2 (pHER2) и pAKT от концентрациипертузумаба (сплошная и прерывистая линии, соответственно) при 95нМ и 1 µМ ErbB2 (толстые и тонкие линии, соответственно). Сераятонкая линия – дозовая зависимость pAKT, рассчитанная привозрастании в три раза скорости реакции фосфорилирования PTEN,катализируемой киназами CK2 и GSK3Точки – экспериментальныеданные. (C) Дозовые зависимости pErbB2 (pHER2) (сплошная линия) иpAKT (прерывистая линия) от концентрации рецепторов ErbB2 вотсутствии (тонкая сплошная линия) и присутствии 100 нМ (тонкаясплошная линия) пертузумаба.
(D) Зависимости чувствительностиполной сигнальной системы SSN (сплошная линия), рецепторной системыSRSS (прерывистая линия) и киназной сигнальной системы SSTS (сераялиния) от концентрации пертузумаба. (E) Результаты Вестерн блотинганализа для pErbB2 (pHER2) (левая панель) и pAKT (правая панель) приразличных концентрациях HRG: 0 nM (контроль), 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM и10 nM, проведеннго на 5 и 30 минутах после добавления в клеточную средуHRG.87полученных кривых видно, что 90% ингибирование рецепторного сигнала,pErbB2, приводит к 80% ингибированию выходного сигнала pAKT.Поведение функции отклика была исследована в зависимости отконцентрации рецепторов ErbB2.
В модели анализировалась зависимостьэффективности действия пертузумаба при повышенных концентрациях ErbB2рецепторов в раковых клетках. Расчеты были выполнены в модели присоотношении концентраций рецепторов ErbB3/ErbB2=1.4, которое близко кэкспериментальным данным для клеточной линии рака яичников PE04, 1.6(Nagumo et al., 2009). Как следует из проведенных расчетов, повышениеконцентрации ErbB2 рецепторов в 10 раз приводит к сдвигу дозовыхзависимостей для pAKT сигнала в сторону высоких концентраций пертузумаба(Рис.
3-2В,С). Вследствие этого возрастают почти в 200 раз значения EC50 и IC50для pErbB2 и pAKT, соответственно. При этом 50% ингибирование pErbB2приводит к 10% ингибированию pAKT при концентрации пертузумаба 100 нМ(Рис. 3-2В). Этот результат показывает, что повышенная экспрессия ErbB2рецепторов приводит к уменьшению чувствительности рецепторной и полнойсигнальных систем к действию пертузумаба при его физиологическихконцентрациях 100 нМ вблизи его значения IC50=40 nM.Исследование функции отклика pErbB2 и pAKT сигналов на действиепертузумаба было выполнено при повышенных уровнях экспрессии ErbB2рецепторов.
Результаты расчетов дозовых зависимостей pErbB2 и pAKT отконцентраций ErbB2 рецепторов, проведенных в отсутствии и присутствии 100nM пертузумаба (2С4 антитела), приведены на Рис. 3-2С. Как видно изполученных данных, при концентрации рецепторов ErbB2=100 nM обе системы,рецепторная и протеин-киназная, находятся в насыщенном активированномсостоянии и ненасыщенном состоянии в присутствии пертузумаба. Приповышении уровня ErbB2 рецепторов обе системы приходят в насыщенноеактивированное состояние в присутствии 100 nM пертузумаба (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
