Диссертация (1097599), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Проведенныерасчеты показывают высокий уровень робастности PI3K/PTEN/AKT сигнальнойсистемы в опухолевых клетках, что обеспечивает пониженную чувствительностьсистемы как к ингибированию внешних (рецепторных) сигналов, так и кизменению внутренних параметров системы за счет компенсаторных мутации вонкогенах и генах онкосупрессоров.Результаты расчетов чувствительности системы при действии комбинациипертузумаба и ингибитора PI3 киназы показали, что чувствительность SAKT,p кпараметрам сигнальных белков уменьшается (Рис.
3-12, колонка 6). Этоприводит к подавлению чувствительности системы к потере активностионкосупрессора PTEN при его мутации: уменьшение экспрессии PTEN не влияетна ингибирующее действие комбинации двух лекарственных препаратов. Этотвывод подтверждает также выполненный расчет действия комбинации двух ЛП:эффективность ингибирующего действия комбинации ЛП не изменяется примутации PTEN, приводящей к потере его активности PTEN (Рис.
3-10 и 3-11).Таким образом, комбинация пертузумаба с ингибитором киназы PI3K приводитк повышению робастности ответа системы на ингибирующее действие ЛП прионкомутациях в PI3K/PTEN/AKT сигнальной сети.108Рис. 3-13. Зависимость pAKT сигнала (сплошные линии) и чувствительностиSAKT,p (пунктирные линии) от концентрации пертузумаба при различныхмодификациях сигнальной системы: для исходной системы (линии 1); при 50%потере экспрессии PTEN (линии 2); при комбинации с ингибитором PI3K,LY294002 (линии 3); при 50% потере экспрессии PTEN и комбинации сингибитором LY294002 (линии 4). Чувствительности SAKT,p рассчитана дляпараметра скорости реакции связывания PIP2 с PI3K, k31.Метод анализ функции отклика сигнальной системы был применен дляисследования дозовой зависимости выходного сигнала pAKT при онкомутацияхв системе и действии второго ЛП, ингибитора киназы PI3K.
На Рис. 3-13приведены результаты расчета зависимости выходного сигнала pAKT отконцентрации пертузумаба в системе без мутаций и при мутации PTEN, а такжепри действии ингибитора киназы PI3K. Показано, что чувствительность SAKT,p кпараметрам системы возрастает в области значения IC50=50 нМ для пертузумаба(Рис. 3-13, пунктирная линия 1). Уменьшение экспрессии PTEN приводит ксдвигу значения IC50 для пертузумаба в область его высоких концетраций (IC50109=800 нМ) отностительно исходного значения, что ведет к резистентности при егофизиологических концентрациях в области 10 нМ-100 нМ.
Действие второго ЛП,ингибитора киназы PI3K, при потере экспрессии PTEN сдвигает значение IC50=800 нМ для пертузумаба в область его физиологических концентраций (Рис. 313, сплошная линия 3). Низкая чувствительность SAKT,p к параметрам системыпри действии PI3K ингибитора для концентрации пертузумаба 100 нМсвидетельствуют, в частности, о подавление чувствительность системы кмутациям PTEN в этой области концентраций ЛП (Рис.
3-13, пунктирные линии3 и 4). В работе также проведены расчеты дозовой зависимоти с учетом мутацийPI3K и AKT, которые дали аналогичные результаты.Отметим, что действия лекарственных препаратов, не вызывающихприобретенную резистентность (устойчивость), были продемонстрированы вонкологической и антибактериальной терапии при комбинационной терапии идля ЛП, обладающих паллиативным действием.110Глава 4.
Влияние лекарственных препаратов на генетическуюрегуляцию в сигнальных системах раковых клетокВ настоящей главе излагаются результаты исследований по влияниюпротивораковых лекарственных препаратов на систему обратных связей (ОС) игенетическую регуляции в сигнальных сетях раковых клеток. Как показалимногочисленныеэкспериментальныеитеоретическиеисследования,эффективность многих ЛП, ингибирующих сигнальные пути раковых клеток,зависит от регуляторных обратных связей в системе, которые могут какповышать, так и понижать эффективность действия ЛП (Rodrigues, Falasca,Zhang, Ong, & Schlessinger, 2000). В последнее время исследование петель ОС всигнальных путях и их роли в механизмах действуют ЛП становиться важнойзадачей как при разработке новых лекарственных препаратов, так и при выбореоптимальной терапии в персонализированной онкологии. Учитывая, что сила ОСи их вклад в регуляцию системы существенно зависят от мутаций генов,кодирующих сигнальные белки, формирующих ОС, влияние обратных связей наэффективность ЛП будет определяться набором мутаций, выявленных уразличных групп пациентов.
Так понижение эффективности ЛП можетпроисходить при ингибировании белков, формирующих петли отрицательныхОС (ООС), что приводит к подавлению силы ООС и вызывает возрастаниесигналов в подсистемах, охваченных данной ООС. В случае ингибированиябелков, формирующих отрицательные связи между различными сигнальнымипутями, действие ЛП может приводить к активации связанного сигнального пути,ведущего, например, к пролиферации клетки и, следовательно, к уменьшениюэффективностиЛП.Так,отрицательныевзаимосвязимеждуанти-апоптотическим PI3K/PTEN/AKT путем и RAS/MEK/ERK сигнальным путемпролиферации клетки приводит в некоторых линиях опухолевых клеток к111уменьшению эффективности ряда лекарственных препаратов, ингибирующиходну из этих сигнальных систем (Turke et al., 2012).В основе метода, разработанного для анализа обратных связей в сигнальныхсистемах клетки, лежит исследование механизмов осцилляторных режимов,возникающих в сигнальных сетях при наличии отрицательных обратных связей,генетической регуляции и взаимосвязей между различными сигнальнымипутями.Рис.
4-1. Отрицательные обратные связи и генетическая регуляция вобъединенной моделе Ras/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальных систем.На Рис. 4-1 приведены отрицательные обратные связи и системагенетическойрегуляция,рассмотренныевмоделиRas/MEK/ERKиPI3K/PTEN/AKT сигнальных систем. Ras/MEK/ERK сигнальная система112находится под контролем отрицательной обратной связи, которая реализуется засчет эффективного ингибирования входного сигнала системы ее выходнымсигналом ppERK. В результате происходит эффективное ингибированиевходного сигнала системы ее выходным сигналом, pERK (RM1 на Рис. 4-1).Молекулярный механизм этой ООС определяется взаимодействием pERK сбелком SOS (фактором обмена гуанин нуклеотида для RasGDPase, GEF, guaninenucleotide exchange factor), что ведет к фосфорилированию SOS с последующейдиссоциацией комплекса-адаптера SOS-Grb2.
Это приводит к эффективномуингибированию RasGDPase в начале Ras/MEK/ERK сигнального пути. Вкинетической модели ООС RM1 pERK-Ras была учтена феноменологически,путем ингибирования активации RasGDPase выходным сигналом ppERK. Сцелью исследования влияния силы ООС pERK-Ras на выходной сигнал системыи возникновение осцилляторных режимов в системе в модели была учтенагенетическая регуляции Ras/MEK/ERK пути, которая находится под контролемppERK сигнала и показана на вставке на Рис.
4-1.В результате исследования осцилляторных режимов в PI3K/PTEN/AKT иRas/MEK/ERK сигнальных путях показано, что мутации и действие ЛП приводяткак к возникновению, так и затуханию осцилляций в сигнальных системах засчет влияния на силу обратных связей. Метод был апробирован в in vitroэкспериментах на MCF-7 линии опухолевых клеток молочной железы, длякоторой в эксперименте наблюдались колебания сигналов pERK и pAKT.4.1.Биоинформационныйанализэкспериментальныхданныхпоэкспрессии генов при активации сигнальных путей клеткиС целью теоретическогоисследованиягенетической регуляциивRas/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальных системах был проведенбиоинформационный анализ экспериментальных данных по экспрессии генов113при активации сигнальных путей клетки. Эксперименты по экспрессии геновпроводилиськоллабораторамипроектавЦентреИсследованийРакаЭдинбургского Университета.
Клетки рака молочной железы MCF-7 былиактивированы геругулиром HRG (1nM) и после 5, 10, 20 и 40 мин экстракт RNAбыл проанализирован с использованием оборудования Illumina® TotalPrep™RNA Amplification Kit (амплификация комплементарной РНК (cRNA)) иIllumina® HT-12 Beadchips (гибридизация). В результате статистическогоанализа экспрессии генов с использованием t-теста (значение р<0.05) былиопределены гены со статистически значимым изменением их экспрессии посравнению с контролем.НаРис.4-2приведенырезультатыстатистическогоанализаэкспериментальных данные для экспрессии генов на 10, 20 и 40 мин. последобавления 1 нМ HRG в клеточную среду. На данном рисунке представлены,главным образом гены, которые находятся под управлением Ras/MEK/ERK иPI3K/PTEN/AKT сигнальных путей.В результате проведенного анализа были обнаружены гены, экспрессируемые врезультате активации Ras/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальных путей.
ВТаблице 4-1 приведены гены, кодирующие белки, которые модулируютактивность сигнальных белков в Ras/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальныхпутях и могут участвовать в формировании обратных связей в системе (Amit,Wides, & Yarden, 2007). Согласно полученным данным, экспрессия геновDUSP1,2,5, кодирующих фосфатазы для ERK1/2 киназы, увеличилась в 2-3.5раза при добавлении HRG в клеточною среду по сравнению с контролем.
На Рис.4-3 приведены зависимости экспрессии генов на 10, 20 и 40 мин. последобавления 1 нМ HRG в клеточную среду. Эти кинетические данные былиучтены в кинетической модели генетической регуляции в Ras/MEK/ERKсигнальном пути, которая обсуждается в следующем разделе.114Рис. 4-2. Генетическая регуляция в Ras/MEK/ERK сигнальном пути в MCF-7клетках. А – экспериментальные данные по экспрессии 50 генов, полученныена 10, 20 и 40 мин. после добавления 1 нМ HRG в клеточную среду.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
