Диссертация (1097599), страница 19
Текст из файла (страница 19)
4-8А). Полученные экспериментальныерезультаты согласуется с теоретическими расчетами по генерации pERKосцилляций в результате уменьшения экспрессии DUSP фосфатазы в модели(Рис. 4-7А).Также в экспериментах на MCF-7 клетках, обработанных CXH, былиобнаружены колебания pAKT сигнала с периодом близким к 20 мин (Рис.
4-8В).СинхронизациямеждуосцилляциямиpAKTиpERKуказываетнасуществование связи между Ras/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальнымипутями. Для описания этой взаимосвязи в модели было учтено взаимодействиемежду RasGTPase и PI3 киназой, которое приводит к дополнительной активацииPI3K (Mendoza, Er, & Blenis, 2011) (Рис. 0-1). В результате учета взаимодействиямежду двумя сигнальными путями модель воспроизводит осцилляции pAKT,123Рис.
4-8. Экспериментальные данные по осцилляторным режима в связаннойPI3K/PTEN/AKT, RAS/MEK/ERK сигнальной сети в клетках MCF-7 и MCF7/HER2 линиях опухолевых клетках молочной железы. A - экспериментальныеданные для pERK1/2(T202/Y204) and (слева) и pAKT(S473) (справа) сигналов(черные линии) и осцилляции pERK и pAKT при действии 10 мкМ CXH (серыелинии). B и C - соответственно, pERK и pAKT осцилляции в клетках MCF7/HER2 с повышенной экспрессией HER2 рецепторов в отсутствие (черныелинии) и в присутствии 100 нМ пертузумаба, 2С4 (серые линии).Экспериментальные точки получены в результате оцифровки данныхВестерн-блоттинг анализа для pERK (T202/Y204) и pAKT (S473) в MCF-7 иMCF-7/HER2 клетках при их активации 1 нМ HRG после нормализации наGAPDH.индуцированные колебаниями pERK в исходных клетках (Рис.
4-7B).Исследование роли генетической регуляции в Ras/MEK/ERK системе показало,что уменьшение уровня экспрессии DUSP фосфатазы приводит к усилениюpAKT осцилляций (Рис. 4-7B), что согласуется с экспериментальными данными124по усиление колебаний pAKT в клетках, обработанных ингибиторомтранскрипции, CXH (Рис. 4-8В).Результаты компьютерных расчетов также показали, что связанныеpAKT/pERK осцилляций возникают в системе при повышенном входномрецепторном сигнале (Рис.
4-7C,D, сплошные линии). В модели увеличениерецепторного сигнала pErbB2 было реализовано повышением концентрацииErbB2 рецепторов. Расчеты также показали, что ингибирование рецепторногосигнала пертузумабом (2С4) приводит к подавлению осцилляций в системе (Рис.4-7C, D, пунктирные линии). С целью экспериментального исследования этогоэффекта были проведены эксперименты на MCF-7/HER2 клетках с повышеннойэкспрессией ErbB2 (HER2) рецепторов (клетки трансфецированные ErbB2геном). В экспериментах были обнаружены связанные колебания pERK и pAKTсигналов, а также наблюдалось подавление колебаний при действии ингибитораErbB2 рецепторов, петрузумаба (Рис.
4-7B,D).125Глава 5. Механизмы репрограммирования сигнальных путей придействии лекарственных препаратов и их комбинацийВ данной главе представлены результаты по исследованию механизмоврепрограммирования сигнальных систем в результате действия антираковыхлекарственных препаратов. К процессам репрограммирования сигнальныхсистем в дальнейшем будут отнесены процессы активации дополнительныхсигнальных путей клетки, которые приводят к компенсации ингибирующегодействия лекарственных препаратов и тем самым вызывают резистентность к ихдействию. Активация компенсаторных сигнальных путей клетки происходит,главным образом, за счет экспрессии набора генов, находящихся подуправлением сигнальной системы, которая является мишенью данного ЛП.
Вработе показывается, что действие лекарственных препаратов может вызыватькак ингибирование экспрессии соответствующих генов, так и активацию генов,кодирующих вторичные сигнальных пути, которые приводят к пролиферацииклеток и дальнейшему росту опухоли. Механизм активации компенсаторныхсигнальных путей связан со сложностью регуляторных связей междуразличными сигнальными сетями, что может приводить к активации однихсистем при ингибировании других. Предполагается, что наблюдаемыеизменения экспрессии генов при лекарственной терапии могут изменять ответсигнальной системы клетки на действия лекарств в результате активацииадаптационного ответа клетки на лекарственную интервенцию. Исследованиеподобныхкомпенсаторныхмеханизмовявляетсяважнойзадачейприисследовании резистентностт к новым ЛП и возникновения побочных эффектовпри их использовании в клинике.
Полученные результаты исследований могутприменятьсядляразработкилекарственнойтерапиипоподавлениюприобретенной резистентности в результате репрограммирования сигнальныхпутей.Вданномразделеразвиваетсяметодисследованияактивации126компенсаторных механизмов клетки при действии ЛП за счет генетическойрегуляции между различными сигнальными путями пролиферации клетки.Метод включает в себя биоинформационный анализ экспрессии генов придействии ЛП, в результате которого был определен набор генов с высокимуровне экспрессии и проанализированы сигнальные пути, которые активируютсяв за счет повышенной экспрессии найденных генов. Далее методамикомпьютерногомоделированияанализируетсявкладкомпенсаторныхсигнальных путей в подавление ингибирующего действия ЛП. Данный методприменен к исследованию репрограммирования сигнальной сети ErbBрецепторов при действии трастузумаба и пертузумаба. Результаты исследованийиспользованы для обоснования эффективности комбинационной терапии дляпреодоления резистентности к лекарственному препарату трастузумабу.Методами компьютерного моделирования было проведено исследованиеингибирующего действия трастузумаба, пертузумаба и их комбинации на линиюопухолевых клеток SKOV3 с высоким уровнем экспрессии HER2 рецептора.Разработанная модель действия ингибиторов ErbB2 рецепторов была примененак анализу in vivo экспериментальных данных, полученных на опухолях SKOV3ксенотрансплантатныхмышей.Экспериментыбыливыполненыколлабораторами проекта в Центре Исследований Рака Эдинбургскогоуниверситета.Результаты экспериментальных исследований эффективностидействия данных ЛП на рост трансплантатной опухоли в течении 35 днейпоказали, что пертузумаб оказывает слабый ингибирующий эффект, трастузумабсущественно замедляет рост опухоли в течении 2 недель, после чего роствозобновляется в то время, как комбинация трастузумаба и пертузумабавызывает полную регрессию опухоли (Рис.
5-1).127Рис.5-1.Экспериментальныеданныеподействиютрастузумаба,пертузумаба и их комбинации на рост опухоли SKOV3 ксенотрансплантатноймыши. Инъекции лекарств сделаны на 0, 3, 7 и 10 день после трансплантацииSKOV3 опухолевых клеток яичника человека (Sims et al., 2012).С целью исследования различия в эффективности трех указанных терапий,направленных на ингибирование PI3K/AKT сигнального пути пролиферацииклетки, был проведен бионформационный анализ изменения экспрессии генов врезультате действия пертузумаба, трастузумаба и их комбинации в клетках насрезах SKOV3 опухоли ксенотрансплантатной мыши.5.1.
Биоинформационный анализ экспрессии генов при действиилекарственных препаратовВ данном исследовании предполагалось, что наблюдаемые измененияэкспрессии генов при лекарственной терапии могут изменять ответ сигнальнойсистемы клетки на действия лекарств в результате активации адаптационногоответа клетки на лекарственную интервенцию. С целью определения ответагенетической регуляции клетки на лекарственную терапию был проведенстатистическийанализэкспрессиигеновпридействиитрастузумаба,128пертузумаба и их комбинации в экспериментах на SKOV3 опухоликсенотрансплантатных мышей.
Результаты статистического анализа более 10000транскрипт представлены на Рис. 5.2, где приведены уровни экспрессии длягенов со статистически значимым изменением экспрессии (р<0.05) по сравнениюс контролем при действии пертузумаба, трастузумаба и их комбинации. Такжерезультаты статистического анализа представлены в виде диаграмм (Volcano plot)на Рис. 5-3, на которых приведены уровни экспрессии генов по оси ординат (log2)и р-значения по оси абсцисс.Из полученных данных видно, что лекарственные препараты и ихкомбинация по-разному влияют на экспрессию генов. Среди генов состатистически значимым увеличением экспрессии при действии трастузумабабыли обнаружены следующие гены HBEGF, FGFR, EPOR, LAMC3, ERBB2,ERBB3, NRG4, VEGFB, SYK, AKT1, PIK3R2, FOXO1, PDGFR и VEGFB.
Каквидно, ингибирование ErbB2 рецепторов в SKOV3 клетках трастузумабомприводит к увеличению экспрессии генов, кодирующих рецепторы какпринадлежащие к семейству ErbB рецепторов, так и принадлежащие к другимгруппам клеточных рецепторов (FGFR, PDGFR и VEGFB).
В работепредполагается, что повышение уровня данных рецепторов в SKOV3 клеткахвызывает дополнительную активацию PI3K/AKT сигнальной системы иприводит к компенсации ингибирующего эффекта трастузумаба. С цельюпроверки данного компенсаторного механизма в SKOV3 клетках былопроведено исследовано влияние возрастания уровня экспрессии ErbB3 гена (в 2раза), кодирующего ErbB3 рецепторы, на подавление ингибирующего эффектатрастузумаба в SKOV3 клетках. Исследование было выполнено в рамкахразработанной модели PI3K/AKT сигнальной системы.129Рис. 5-2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
