Диссертация (1097599), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Величина экспериментальных точек пропорциональна клеточногоскоростироста.НавставкахприведеныснимкиклетокNRF2иммунофлуресцентным методом.Полученные результаты также по были проверены в экспериментах поизмерению H2O2 концентрации в клеточных линиях рака яичников при действииингибиторов ErbB2 рецепторов. Результаты работы опубликованы в работе [5]из списка публикаций по теме диссертации. В экспериментах было обнаруженоувеличение уровня H2O2 при активации клеток HRG, а также при действиипертузумаба, трастузумаба (TR) и их комбинации на клеточные линии ракаяичников PE04, OVCAR4, SKOV3 (Рис. 7-5А,В).
Также в экспериментах было153показано уменьшение концентрации фактора транскрипции NRF2 и основныхантиокислительных ферментов, экспрессия которых находится под управлениемNRF2.Таким образом, на основе совместного моделирования PI3K сигнальнойсистемы и NRF2-зависимой антиокислительной системы клетки установлено,что действие лекарственных препаратов, ингибиторов ErbB3/ErbB2 рецепторов,приводит к окислительному стрессу, что может являеться дополнительнымфактором ингибирующего действия указанных лекарственных препаратов.Рис. 7-5. Экспериментальные измерения концентрации H2O2 в клеточныхлиниях рака яичников PE04, OVCAR4, SKOV3 при активации клеток HRG (А) идействии пертузумаба (PR), трастузумаба (TR) и их комбинации (COMB).Измерения проведены на 1,2,3 и 4 сутки после добавления лекарственныхпрепаратов.154ЗаключениеНа основе развитого метода компьютерного моделирования действиялекарственных препаратов онкотерапии на сигнальные пути клеточнойпролиферации в работе получены следующие результаты:1.
Разработаны методы моделирования сложных сигнальных систем клеточнойпролиферации, позволяющие анализировать изменения динамическихрежимов функционирования системы в зависимости от онкомутаций враковыхклетках,атакжеисследоватьэффективностьдействиялекарственных препаратов, направленных на ингибирование сигналов,управляющих ростом опухолевых тканей.2.
Развита кинетическая модель активации ERK и PI3K сигнальных путейпролиферации в раковых клетках на основе детального описанияфункционирования отдельных сигнальных белков, учета регуляторныхсвойств сигнальной системы и большого набора экспериментальных данных,полученных на популяциях раковых клеток. Применение модели длятестирования действия лекарственных препаратов показало эффективностьнового лекарственного препарата, ингибитора ErbB2 и ErbB3 рецепторов(пертузумаба) для подавления активации PI3K сигнального пути в линияхопухолевых клеток яичников. В результате моделирования определенмолекулярный биомаркер эффективного действия лекарственных препаратов:соотношение экспрессии рецепторов ErbB3/ErbB2.3. На основе анализа выходных характеристик сигнальной системы определенуправляющийпараметрсистемы,характеризующийсоотношениеактивностей трех сигнальных белков =PTEN/PI3K/AKT.
Показано, чтовведенный параметр управления является биомаркером, определяющимэффективность ингибиторов ErbB3/ErbB2 рецепторов при онкомутациях вPI3K сигнальной системе. Разработанный биомаркер подтвержден в155экспериментах на клеточных линиях опухоли яичников и в клиническихисследованиях на группе онкологических пациентах с мутациями PTEN гена.4.
На основе анализа динамических режимов функционирования сигнальнойсистемыпредложенаконцепцияпереходарезистентность», который имеет место«чувствительность-в системе приизмененииуправляющего параметра и ведет к потере чувствительности системы поотношению к входному сигналу и ингибированию рецепторных сигналов.Установлено, что возникающая при этом лекарственная резистентностьобусловлена активацией компенсаторных механизмов в сигнальныхсистемах клетки при мутациях генов PTEN, PIK3CA и AKT.
Предложен методподавлениярезистентностипутем«чувствительность-резистентность»реализацииврезультатеобратногопереходакомбинациидвухлекарственных препаратов, действующих на разные модули сигнальнойсистемы.5. Разработан метод модификации функции отклика сигнальной системы путемизменения параметра управления системы , что позволило развить методкомбинированного действия двух лекарственных препаратов для подавлениярезистентности к ингибиторам клеточных рецепторов при различныхонкомутациях. Показано, что ингибирование киназы PI3K в комбинации сингибитором клеточных рецепторов восстанавливает чувствительность PI3Kсигнальной системе к действию ингибиторов ErbB3/ErbB2 рецепторов прионкомутациях генов PTEN, PIK3CA и AKT.
Эффективность комбинацииингибиторов ErbB3/ErbB2 рецепторов и PI3K киназы подтверждена вэкспериментах на клеточных популяциях опухоли яичников.6. Развит методов, позволяющий учитывать генетическую регуляцию вкинетических моделях сигнальных систем на основе биоинформационногоанализа экспериментальных данных по изменению экспрессии генов приактивации сигнальных систем и действии лекарственных препаратов.156Установлен механизм возникновения осцилляторного режима в связаннойERK, AKT сигнальной системе за счет отрицательной обратной связи в ERKсистеме при нарушении генетической регуляцией. Предсказанный в моделиосцилляторный режим подтвержден в экспериментах по наблюдениюосцилляций в популяции раковых клеток.7.
Разработан метод тестирования лекарственных препаратов, ингибиторовпротеин-киназ в PI3K сигнальном пути: ингибитора mTOR1 комплекса(рапамицин), ингибитора киназы PI3K и ингибитора двойного действия BEZ235 для линий клеток опухолей яичников с онкомутациями в сигнальныхсистемах. Установлено, что действие рапамицина приводит к эффективномуингибированию выходного сигнала системы (рS6K1), но вызываетактивацию промежуточного AKT сигнала в результате подавленияотрицательных обратны связей в PI3K сигнальном пути.
Показано, что висследуемых раковых клетках активации AKT является биомаркеромэффективного действия рапамицина.8. Установлено, что для анализа длительного действия лекарственныхпрепаратов, ингибиторов клеточных рецепторов, необходимо учитыватьмодификацию (репрограммирование) сигнальных систем в результатеактивации компенсаторных сигнальных путей клеточной пролиферации приизменениипрепаратов.экспрессииПредложенагенов,вызванныхкомбинированнаядействиемтерапиялекарственныхдляподавлениярезистентности системы, возникающей при активации компенсаторныхмеханизмов клетки в результате репрограммировании сигнальных путей.9.
На основе совместного моделирования PI3K сигнальной системы и NRF2зависимой антиокислительной системы клетки установлено, что действиелекарственных препаратов, ингибиторов ErbB3/ErbB2 рецепторов, приводитк окислительному стрессу, что является дополнительным факторомингибирующего действия указанных ЛП.157Приложение 1. Характеристики лекарственных препаратовЗависимость значения IC50 oт ATP концентрации для лекарственногопрепарата BEZ235Перепишем уравнение скорости реакции 4EBP1 фосфорилирования mTORкиназой в присутствии ATP-конкурентного ингибитора BEZ23541 =41 ∙ 1 ∙ 41 ∙ ,,41 ⋅ , ∙ ∆(S1)где∆ = (1 +41+) (1 +)., ,,41В соответствии с определением значение IC50 может быть найдено изуравнения41 ( = 50 ) 1= ,41 ( = 0)2(S2)где 41 ( = 50 ) и 41 ( = 0) – скорости реакции 41 вотсутствии ингибитора BEZ235 и при его концентрации равной значению IC50 .Подставляя 41 (S1) в уравнение (S2) получаем∆ ( = 0)=2∆ ( = 50 )или15850+(1 + , ),= 2.(1 + ),Окончательно получаем уравнение50 = , (1 +).,Соотношение между величиной IC50 и константой диссоциации длярапамицина.Для вывода соотношения50 = , ,используем следующее соотношение для величины IC50141 ( = 50 ) = (,41 + ,41 ),2где ,41 и(S3),41 – aскорости реакции 41 в отсутствиирапамицина и при его высоких концентрациях (>>,2 ), соответственно.Подстановка ур.
(S1) в ур. (S3) дает1 + 4150,501+,1= (1 + 41 ),2(S4)где константа диссоциации , равна либо ,1 , либо ,2 взависимости от присутствия или отсутствия белка FKBP12. Ур. (S4) можетбыть преобразована к виду(1 −50) (41 − 1) = 0,,что окончательно дает искомое соотношение15950 = , .Зависимость величины IC50 для ATP-конкурентного ингибитора от ATPконцентрации для PI3K киназы.Вместо решения для кинетики ADP= 3решается уравнение для кинетики ATP= −3 ,(S5)где 3 – скорость реакции для PI3K3 =3 ∙ 3 ∙ 2 ∙ ,2 ⋅ , ∙ ∆3и∆3 = (1 +2++) (1 +).,2, , ,Перепишем уравнение для скорости реакции 3 в следующей форме3 = ∙ ∙ + (1 +, ),где I – концентрация ингибитора либо LY293002, либо BEZ235,=3 ∙ 3 ∙ 2,,2 ⋅ ,=, = (1 +,2).,2Здесь , – константа диссоциации ингибитора либо LY293002, либо BEZ235.160Интегрирование ур. (S5) производится от времени начала реакции t=0 доконечного времени t=tm, когда реакция была остановлена в эксперименте иконцентрация ADP была измерена ( , ) = 0 − ( , ) .
Тогдарешение ур. (S5) имеет вид( − 0 ) = − (1 +) () − .,0(S6)Также можно записать решение 0 = ( , = 0) в отсутствииингибитора (I=0).(0 − 0 ) = − (0) − .0(S7)При концентрации ингибитора равной величине IC50 , I=IC50 , отношение левыхчастей уравнений (S6) и (S7) равно − 01== .0 − 0 0 2(S8)Тогда результат деления ур. (S6) на ур. (S7) можно записать в следующейформе1=250 (+ ),0 ).0 (+ 0 ) (1 +Это уравнение дает следующее выражение для зависимости величины 50 отначальной концентрации 050где =0 (− 0 )= , (− 1),2 (0 )(S9), = ( , = 50 ), and 0 = ( , = 0).Выражая отношение0через отношение00, используя ур.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
