Диссертация (1097599), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Стрелкамипоказаны mRNA для DUSP1,2,5 генов. Цвет соответствует изменениюэкспрессии по сравнению с контролем в соответствии со шкалой, приведеннойсправа.115Таблица 4-1. Гены кодирующие белки, которые учавствуют в формированииобрантных связей в Ras/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальных путях.ГеныDUSP1DUSP2DUSP5CYR61CTGFRASD1PPP1R15AРегуляторный элемент в ERK и AktпутяхERK1/2 дефосфорилированиеERK1/2 дефосфорилированиеERK1/2 дефосфорилированиеАктивация Akt и ERK1/2Активация AKTИнгибирование ERK1/2Ингибирование дефосфорилированияAKT PP1 фосфатазойВ результате анализа было обнаружено, что число экспрессирующийсягенов изменяется со временем с существенным увеличением уровня экспрессиипосле 10 мин (160 транскриптов), после 20 мин (450 транскриптов) и 40 мин (390транскриптов). Проведенный Анализ Представленности Функциональных ГруппГенов (functional enrichment analysis) показал, что HRG приводит ксущественному увеличению экспрессии генов, находящихся под контролемMAPK сигнального пути, в MCF-7 клетках после 20 мин активации (Nagashimaet al., 2007).
Среди основных генов, являющиеся маркерами активации MAPKсигнального пути, были обнаружены следующие гены с высоким уровнемэкспрессии DUSP1, DUSP5, EGR1, KLF2, JUNB, ZPF36, DDIT3, CTGF, FOS,FOSB и MYC. Результаты полного анализа представленности функциональныхгрупп генов даны в Приложении 2. На Рис. 4-2 представлены 50 генов снаибольшим уровнем экспрессии, полученные в проведенном анализе.116Рис.
4-3. Зависимость экспрессии генов от времени с начала активацииRas/MEK/ERK сигнальном пути при активации популяцию MCF-7 клетоклигандами HRG и EGF (красная и синяя линии, соответственно).На основе полученных результатов по зависимости экспрессии генов отвремени была предложена схема активации ERK1/2 киназой факторовтранскрипции, регулирующих экспрессию генов на начальной стадии (IEG,immediate-early gene) и на второй стадии (DEG, delayed-early gene) генетическойрегуляции (Amit et al., 2007). Схема генетической регуляции представлена на Рис.4-4.117Рис. 4-4. Схема активации ERK1/2 киназой факторов транскрипции,регулирующих экспресию генов на первой стадии (IEG, immediate-early gene)и второй стадии (DEG, delayed-early gene) генетической регуляции (Amit et al.,2007).Согласно модели генетической регуляции на начальной стадии ERK1/2киназа фосфорилирует фактор транскрипции Elk-1 (ETS domain-containingprotein), который относится к TCF (ternary complex factor), в результате чегопроисходит экспрессия генов начальной стадии регуляции (IEG: FOS, JUN,EGR1) после 10-20 мин с начала активации клеток лигандом HRG.
На второйстадии после 40 мин происходит формирование фактора транскрипции AP-1(Activator protein 1), который в качестве субъединиц включает гетеродимер FOSи JUN. AP-1 является фактором транскрипции для генов второй стадиирегуляции, которые экспрессируются на 40 мин. На основе проведенного анализаследующие гены были отнесены к группе генов, экспрессирующийся на второйстадии регуляции: DUSP1, DUSP5, KLF2, JUNB, ZPF36, DDIT3, CTGF, FOSB,MYC, EGR3 и др.Гены DUSP1, DUSP2 и DUSP5 кодируют фосфатазы DUSP1,2,5 (dualspecificity phosphatase DUSP-family), которые дефосфорилируют киназу pERK1/2и реализуют отрицательную обратную связь в генетической регуляции118Ras/MEK/ERK сигнального пути.
На основе полученных данных быларазработана модель генетической регуляции и развита объединенная модельRas/MEK/ERK сигнального пути с ученом генетической регуляции.4.2. Модель генетической регуляции сигнальных системРазработанная модель генетической регуляции описывает ERK-зависимыймеханизм активации транскрипционных факторов, которые контролируютэкспрессию генов DUSP1,2,5, реализующих отрицательную обратную связь вRas/MEK/ERK сигнальном пути. В кинетической модели генетическойрегуляции был реализован двухступенчатый механизм экспрессии фосфатазDUSP1,2,5 при активации ERK киназы (см.
схему модели на Рис. 4-4 и 4-5).Рис. 4-5. Cхема двухступенчатой модели экспрессии фосфатаз DUSP1,2,5,включающей раннюю и позднюю экспрессию генов.Модель включает в себя 4 ОДУ, описывающих кинетику mRNA второгофактора транскрипции mRNATF2 и фосфатазы DUSP, а также второго факторатранскрипции TF2 и экспрессируемых белков DUSP:119где mRNATF2 и mRNADUSP – концентрации mRNA генов, кодирующих второйтранскирипционный фактор TF2 и фосфатазу DUSP; функция F(ppERK,TF1),имеющая вид функции Михаэлиса-Ментен, описываетактивацию первоготранскрипционного фактора TF1 (TCF) в результате его фосфорилированияактивной киназой ppERK; функция G(TF2) описывает активацию второготранскрипционного фактор TF2; константы αR1 и αR2 - силы промоторов; αR1 и αR2– скорости трансляции; βRi и βEi – скорости деградации mRNA и белков,соответственно.
Детали модели и набор кинетических параметров приведены всовместной статье (Hu et al., 2013).Рис. 4-6. Теоретические зависимости экспрессии mRNA DUSP (черная линия)и mRNA для фактора транскрипции NF2 (синия линия) в кинетической модели(4-1)-(4-6). Точки-экспериментальные данные, приведенные на Рис.
4-3.120Параметры модели генетической регуляции были выбраны на основелитературных данных и наилучшего описания временной зависимостиэкспрессии mRNA DUSP1,2,5, полученной в экспериментах (Рис. 4-3 и 4-6).Кинетическая модель генетической регуляции (4.1)-(4.4) была объединена смоделью Ras/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальной системы с цельюисследования взаимодействия двух отрицательных обратных связей: ООС вMAP-киназной сигнальной системе, за счет эффективного ингибированиеактивации Ras выходным сигналом ppERK, ppERK-Ras, и генетической ООС,pERK-DUSP.4.3. Моделирование осцилляторных режимов как метод исследованияобратных связей в сигнальных системахРазработанная объединённая модель Ras/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKTсигнального пути с генетической регуляции была применена к исследованиюдвух взаимодействующих регуляторных связей в данной системе: генетическойи протеин-киназной ООС.
Исследование характера временной зависимостивыходногосигналаppERKвмоделипоказало,чтоконцентрацияэкспрессируемой фосфатазы DUSP существенно влияет на выходной сигналRas/MEK/ERK сигнальный системы, что приводит к модуляции отрицательнойобратной связи ppERK-RAS. При выбранных параметрах объединенной моделивыходной сигнал сигнальной системы, ppERK, представляет собой сигнал смаксимумом при 20 мин и маловыраженными затухающими колебаниями (Рис.4-7А, тонкая сплошная линия). При частичном ингибировании генетическойобратной связи в результате уменьшения уровня экспрессии фосфатазы DUSP всистеме наблюдались затухающие колебания высокой амплитуды (Рис. 4-7А,толстая сплошная линия). В этом случае уменьшение силы генетической ООСведет к возрастанию амплитуды выходного сигнала ppERK в системе.
При121Рис. 4-7. Результаты теоретических расчетов сцилляторных режимов всвязанной PI3K/PTEN/AKT, Ras/MEK/ERK сигнальной сети в клетках MCF7 и MCF-7/HER2. (A) – осцилляции pERK сигнала при различных величинахобратной генетичеcкой связи: при включенной генетической связи (тонкаясплошная линия, αR1 ); при 50% ингибировании генетической связи (толстаясплошная линия, 0.5 αR1 ) и при полном ингибировании генетической связипри действии CHX (пунктирная линия, αR1=0). B - осцилляции pAKT привключенной генетической связи (сплошная линия) и при полном ееингибировании при действии CHX (пунктирная линия).
С и D –соответственно, осцилляции pERK и pAKT в клетках MCF-7/HER2 сповышенной экспрессией HER2 рецептора (сплошные линии) и подавлениеpERK и pAKT осцилляций при действии 100 нМ пертузумаба, 2С4,(пунктирные линии).полном отключении генетической ООС в системе происходит бифуркациярежима функционирования с возникновением незатухающих колебаний вRas/MEK/ERK сети, в частности, колебаний рpERK сигнала с периодом 20 мин.(Рис. 4-7А, пунктирная линия).122Также установлено, что дополнительным механизмов возникновения колебанийв модели помимо подавления генетической ООС является нелинейный характерфункции ингибирования входного сигнала RasGTP выходным сигналом ppERK.В модели функция, описывающая ООС в сигнальной системе, характеризуетсяпараметром Хилла n = 3.
Предполагается, что нелинейность ООС определяетсясложнымхарактеромкинетикикаскадареакций,которыйвключаетфосфорилирование фактора SOS активной киназой рpERK с последующейдиссоциацией комплекса Grb2-SOS (активирующего RasGDPase), что ведет кингибированию входного сигнала в Ras/MEK/ERK сигнальном пути.С целью экспериментального исследования взаимодействия двух ООС ироли генетической регуляции в Ras/MEK/ERK сигнальном пути был проведенэксперимент по блокировке генетической ООС ингибитором транскрипциициклогексимидом (10 μМ CXH) в клеточной линии рака молочной железы MCF7. Эксперимент был выполнен коллаборатором проекта в Центре ИсследованияРака Эдинбургского Университета. В экспериментах были обнаруженыосцилляции pERK сигнала с периодом 20 мин при ингибировании транскрипциициклогексимидом (10 μМ CXH) (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
