Диссертация (1097599), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Как показали расчеты, действие BEZ-235 соединяет в себе основныесвойства ингибиторов mTOR1 и PI3K. BEZ-235 оказывает существенноеингибирующее действие на основные субстраты mTOR1 комплекса: S6K1 и4EBP1. При его действии не происходит дополнительной активации AKTсигнала, механизмы которой обсуждались выше. Ингибирование PI3K (Kd=1.6нМ) и комплекса mTOR2 (Kd=0.56 нМ) при действии BEZ-235 предотвращаетактивацию AKT и приводит к эффективному подавлению pAKT сигнала.С целью исследования корреляции между ингибирующим действиемлекарственных препаратов на сигнальные пути и рост клеточных популяцийраковых клеток был проведен анализ экспериментальных данных поингибированию роста PE04 и A2780 клеток (Рис.
6-8А). Согласно результатам145анализа экспериментальных данных полученных коллабораторами проекта вЦентре Исследования Рака Эдинбургского Университета, клетки A2780обладают более высокой скоростью роста по сравнению с PE04 клетками (0.791/сут. и 0.27 1/сут). Это связано с частичной потерей активности PTEN гена вA2780 клетках, что приводит к повышенной активности AKT, S6K1 и 4E-BP1киназ, которые подавляют апоптоз клеток и активируют трансляции многихбелков, повышая тем самым скорость пролиферацию клеток. Для оценкивлияния данных лекарств на скорость роста PE04 и A2780 клеток былипроведены расчеты относительного изменения скорости роста клеток = (0 − )/0 , где 0 и - скорости роста клеток в отсутствии и присутствии ЛП.Расчеты покали, что относительные изменение рост клеток при действииданных лекарства на PE04 и A2780 клетки различаются несущественно (Рис.18Б).
Анализ экспериментальных результатов также показал, что ингибитордвойного действия BEZ-235 оказывает наибольший ингибирующий эффект нарост как PE04, так и A2780 клеток по сравнению с другими рассмотреннымиингибиторами.Рис. 6-8. Экспериментальные результаты по ингибированию количества клеток(А) и относительного изменения скорости роста (Б) в популяции PE04 и A2780опухолевых клеток при действии ЛП, рапамицина, L294002 и BEZ235.146Учитывая высокую степень резистентности многих линий раковых клетокк рапамицину в работе анализируется предложенные в клиническихисследованиях биомаркеры чувствительности к рапамицину, такие какдополнительная активация AKT при его действии и мутации PTEN гена.
Исходяиз полученных экспериментальных данных (Рис. 18) можно заключить, что, хотяA2780 клетки с PTEN мутацией проявляют повышенную чувствительность крапамицину (90% ингибирование роста клеточной популяции) по сравнению сPE04 клетками (30%), относительная степень ингибирования скорости роста, ,в этих клеточных линиях почти одинакова (50% и 57% для PE04 и A2780 клеток,соответственно). Также показано, что дополнительная активация AKT приполной делеции PTEN гена не может служить биомаркером эффективностирапамицина, т.к.
указанная активация исчезает при полной потере активностиPTEN.Также в работе проанализировано влияние ингибирования различныхсигнальных белков на подавлении роста раковых клеток. Учитывая, что mTOR1ингибитор, рапамицин, приводит не к ингибированию, а к дополнительнойактивации рAKT сигнала в PE04 и A2780 клетках, в работе делается вывод, чтоосновным механизмом ингибирования роста популяций PE04 и A2780опухолевых клеток является подавление активации субстратов mTOR1, S6K1 и4E-BP1 киназ, которые регулирует процессы трансляции многих белков,обеспечивающих пролиферацию клеток.
Ингибитор двойного действия BEZ-235оказывает наибольший ингибирующий эффект за счет ингибирования S6K1 и4E-BP1 киназ и подавления дополнительной активации AKT в результатеослабления обратной связи в сигнальном пути.147Глава7.Влияниелекарственныхпрепаратовнарегуляциюантиокислительной системы в раковых клеткахВ данной главе приводятся результаты моделирования клеточной системырегуляции антиокислительного ответа клетки при действии ингибиторовклеточных рецепторов. Цель работы заключалась в исследовании влиянияингибирования выходных сигналов pAKT и pERK на антиокислительнуюсистему (АОС) клетки, которая находится под контролем фактора транскрипцииNRF2.
В рамках разработанной модели учтено, что в возрастание pERK сигналаприводит к увеличению экспрессии NRF2 за счет фосфорилирования факторатранскрипции киназой pERK (см. описание четвертой главы).ВозрастаниеpAKT сигнала, в свою очередь, приводит к ингибированию деградации NRF2 засчет инактивации киназы GSK3 при ее фосфорилировании киназой pAKT (см.главу 2).
При ингибировании pAKT и pERK сигналов в результате действияингибиторов рецепторов происходит понижение уровня NRF2 и, как следствие,снижение активности антиокислительной системы клетки, приводящее квозрастанию концентрации активного кислорода и перекиси водорода H2O2 вклетке. С целью исследования механизма регуляции АО ответа раковых клетокна действие рецепторных ингибиторов была развита модель NRF2 сигнальнойсистемы, контролирующей АО ответ в клеточных линиях рака яичников.Развитая модель включает в себя 3 системы: сенсорную, генетическую иферментативную антиокислительную системы, которые связаны между собойпетлей отрицательной связи регуляции (Рис. 7-1). Сенсорная система включает вформирование комплекса NRF2-KEAP1, окисление KEAP1 в результатедействия H2O2 и, приводящее к деградация NRF2.регуляциивключаетдиффузиюNRF2вядроГенетическая системаклетки,формированиеактивационного и репрессорного факторов транскрипции в результатеформирования комплексов NRF2-MAF и MAF-MAF, их связывание с ARE148сайтами DNA, активация и репрессия экспрессии NRF2-зависимых ферментовАОС.
В модели антиокислительная система клетки включает следующие белки,регулирующиеокислительно-восстановительногопотенциалаклетки:тиоредоксин перексидазу, тиоредоксин, тиоредоксин редуктаза, глутатионперексидазу, глутатион и глутатион редуктаза. Отрицательная обратная связьформируется за счет восстановления окисленного белка KEAP1 ферментамиРис. 7-1.
Схема модели NRF2- KEAP-сигнальной системы, контролирующейокислительно-восстановительного баланс клетки.АОС, приводящего к диссоциации комплекса NRF2-KEAP1 и накоплению NRF2в цитоплазме.Полная модель NRF2- KEAP-сигнальной системы приведена вПриложении 3.Развитая модель была применена к описанию функционирования NRF2зависимой сигнальной системы в следующих раковых клетках яичниковOVCAR3, OVCAR4, PEO1, PEO4, PEO6 и SKOV3 с различным уровнемэкспрессии NRF2 и KEAP1 белков [5]. Экспериментальные работы по проверкетеоретических расчетов были проведены коллаборатором проекта в Абертей149Университете.
Результаты моделирования сенсорной NRF2-KEAP1 системыприведены на Рис. 7-2А, где показано деградация NRF2 в результате окисленияKEAP1 в 7 клеточных линиях при отсутствии генетической регуляции придействии CHX. Результаты моделирования антиоксидантной системы клеткиприведены на Рис. 7-2Б, где показана кинетика деградации H2O2 ферментамиАОС. Видно, начальной стадии деградации H2O2 сопровождается увеличениемэкспрессии тиоредоксин перексидазы (Pxtot) и ее окислением (Pxox).
Модельантиоксидантной системы раковых клеток была опубликована в работах [3, 8, 9]из списка публикаций по теме диссертации.Рис. 7-2. (А) Функционирование сенсорной NRF2-KEAP1 системы: деградацияNRF2 в результате окисления комплекса NRF2-KEAP1 при действииэндоклеточной H2O2для клеточных линий с различным соотношениемNRF2/KEAP1: HaCaT (), PEO1 (PEO4 ().
Точки – соответствующие экспериментальныеданные.), OVCAR4 (), SKOV3 (), PEO6 (), OVCAR3 (),(Б) Функционирование антиоксидантой системы: кинетикадеградация экзоклеточной H2O2 (черная линия), восстановленной Pxred(фиолетовая линия), окисленного фермента Pxox (синия линия) пероксидазыпри добавлении в систему 5 M H2O2 в нулевой момент времени. Точки –экспериментальные данные для HaCaT ( ) и OVCAR3 ( ) клеток.Для учета генетической регуляции развита кинетическая модельэкспрессию NRF2-зависимых белков АОС.
Модель включает следующие ОДУ,150описывающие кинетику формирования активационного NRF2-MAF факторовтранскрипции за счет образования комплекса NRF2 с белком MAF ирепрессорного факторов транскрипции MAF-MAF, а также их связывание с AREсайтом DNA, NRF2-MAF-ARE и MAF-MAF-ARE:_= 1 ( ∙ − 1 _)2_= 2 ( ∙ 2 − 2 2_ )2__= 3 (2_ ∙ − 2 ∙ 2__)__= 4 (_ ∙ − 2 ∙ __)Расчеты были выполнены с экспериментальными значениями константскоростей реакций и констант диссоциации 2 для активационного ирепрессорного комплексов и их связывания с промотерными сайтами(Yamamotoet al., 2006).
Расчеты показали, что при возрастании концентрации NRF2 в ядреклетки в результате повышения уровня H2O2 нарушается баланс междуактивационным и репрессорным комплексами факторов транскрипции, чтоприводит к увеличению экспрессии ферментов антиоксидантной системы клетки(Рис. 7-3).На основе разработанной модели была рассчитана регуляторнаяхарактеристика NRF2-KEAP1 сигнальной системы: зависимость NRF2 отвнутриклеточного уровня H2O2. При низких концентрациях H2O2 деградацииNRF2 в комплексе NRF2-KEAP1 приводит к низкому уровню NRF2.
Привозрастании внутриклеточного концентрации H2O2 регуляторная кривая имеетгистнерезистной характер, что соответствует функционированию сенсорной ирегуляторной систем. В этой области концентраций H2O2 в клетке происходитнакопление фактора транскрипции NRF2, формирование в ядре активационногокомплекса NRF2-MAF и инициация транскрипции ферментов АОС клетки.Механизм регуляции отключается при достижении максимальной концентрацииNRF2, обеспечивающий максимальный синтез ферментов антиоксидантной151системы клетки.
Дальнейшее увеличение внутриклеточного уровня H2O2 невызывает АО ответа клетки, что приводит к окислительному стрессу.Рис. 7-3. Функционирование генетической подсистемы регуляции NRF2сигнальной системы: зависимость концентрации активаторного NRF2-MAF() и репрессорного MAF-MAF () комплексов с ARE сайтами DNA.Приведенные данные для H2O2 концентрации для ряда клеточных линийрака яичников на Рис. 7-4 показывают, что многие раковые клетки находятся внеобласти регуляции NRF2 АО системы (PE01, PE06 и SKOV3). Это предполагает,что многие раковые клетки находятся под окислительным стрессом.
Данныерезультаты моделирования был проверены в экспериментах по индуцированиюокислительного стресса в раковых клетках и результаты опубликованы в работах[3,8,9] из списка публикаций по теме диссертации.152Рис. 7-4. Регуляторная кривая NRF2 сигнальной системы: зависимостьконцентрации NRF2 в клетке () и ядре () от внутриклеточного уровняH2O2. Точки – экспериментальные данные для 7 клеточных линий ракаяичников.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
