Диссертация (1097599), страница 16
Текст из файла (страница 16)
КонцентрацияpAKT взята равной расчетному значению на 30 мин после инициации сигналапри действии HRG. Точки – экспериментальные данные для клеточной линииPE04.высоких концентраций пертузумаба. При этом IC50 возрастает с 40 нМ дляисходной (немодифицированной системы) до 1 µМ для системы с потерейактивности PTEN и управляющим параметром 0.5. Полученная дозоваязависимость свидетельствует о резистентности системы к действию пертузумабапри его физиологических концентрациях в области 100 нМ (экспериментальныеточки). Как показали расчеты, добавление ингибитора PI3K, LY294002 (5 M),102сдвигает модифицированную дозовую зависимость (линия 2) в область исходнойдозовой зависимости с IC50 40 нМ (линия 3), что возвращает исходнуючувствительность системы к ингибирующему действию пертузумаба в областиего концентраций 100 нМ.Рис. 3-10. Расчет дозовой зависимости pAKT сигнала от концентрацииингибитора PI3K, LY294002 для исходной сигнальной системы (сплошнаякривая) и при пониженной активности PTEN (пунктирная кривая) придействии ингибитора PTEN, bpV(pic), (50 нM).Отметим, что согласно расчетам, падение уровня PTEN приводит также крезистентности к ингибитору PI3K, LY294002.
Как видно из приведенной на Рис.3-10 дозовой зависимости pAKT сигнала от концентрации ингибитора PI3K,LY294002,припониженнойактивностиPTENсигнальнаясистеманечувствительна к действию ингибитора в области его физиологическихконцентраций 2 µМ - 5 µМ. Таким образом уменьшение активности PTEN,вызванное мутациями гена PTEN, приводит к резистентности как к действиюингибитора рецепторов, так и к действию ингибитора киназы PI3K. Но вместе стем, как показали результаты моделирования приведенные выше, их совместноедействиеприводит кактивности PTEN.подавлениюрезистентности, вызваннойпотерей103Рис. 3-11.
Сравнение экспериментальных и теоретических результатов поингибирующему действию пертузумаба, возникновения резистентности к егодействиюпринизкойактивностиPTENиэффектаподавлениярезистентности при комбинационной терапии. Активация pAKT на 30 минутепосле добавления 1 нМ HRG (столбец 2), ингибирование pAKT при действиипертузумаба, 2С4 (3).
Действие комбинации двух ингибиторов: пертузумаба иингибитора PI3K, 5 μM LY294004 (4). Отсутствие ингибирующего эффектапертузумаба при ингибировании активности PTEN при действии 50 нM bpV(pic)(5). Восстановление ингибирующего эффекта пертузумаба при пониженнойактивности PTEN путем добавления ингибитора PI3K, 5 μM LY294004 (6).Действие ингибитора LY294004 (7). Действие ингбитора PTEN, 50 нМ bpV(pic)(8). Результаты моделирования показаны черным цветом, экспериментальныеданные - серым цветом. Величина pAKT сигнала нормирована на егомаксимальную величину при активации HRG.С целью проверки результатов моделирования и сделанных предсказанийбыли проведены экспериментальные исследования действия комбинацииингибиторов пертузумаба и LY2940002 на активацию AKT в опухолевыхклеткахPE04приразличныхуровняхактивностиPTENфосфатазы.104ЭкспериментыбыливыполненыколлабораторамипроектавЦентреИсследования Рака Эдинбургского Университета.
На Рис. 3-11 приведеносравнение экспериментальных результатов с результатами компьютерногомоделирования следующих эффектов: ингибирующего действия пертузумаба,возникновения резистентности к его действию при низкой активности PTEN иэффекта подавления резистентности при комбинационной терапии. Столбцы 2,3 и 4 на Рис. 3-11 соответствуют уровню pAKT при активации системы придобавлении в клеточную среду HRG, ингибированию pAKT сигналапертузумабом (2С4) и ингибитором PI3K LY294002, соответственно. Столбец 5соответствуетподавлениюингибирующегоэффектапертузумабаприуменьшении активности PTEN.
В экспериментах активность PTEN быласниженадействиемингибитораbpV(pic).Экспериментальныеданныеподтверждают результат компьютерного моделирования по возникновениюрезистентности к действию ингибитора рецепторного сигнала при потереактивностифосфатазыPTEN.Экспериментыпоказали,чтодействиекомбинации пертузумаба с ингибитор PI3K, LY2940002, на клетки с пониженнойактивностью PTEN приводит к подавлению резистентности pAKT сигнала кдействию пертузумабу, вызванной потерей активности фосфатазы PTEN, ивосстанавливает ингибирующее действие пертузумаба (столбец 6).3.7.
Влияние онкомутаций на чувствительность сигнальных системклетки к действию лекарственных препаратовC целью определения ключевых элементов сигнальной сети, оказывающихнаибольшее влияние на выходной сигнал системы, развит метод исследованиячувствительности выходного сигнала системы к кинетическим параметрамсигнальных белков и уровням их экспрессии.Определение наиболее105чувствительныхэлементовсигнальнойсистемыврезультатеанализчувствительности сигнальных систем применяется в дальнейшем для 1)определения белков-мишеней для эффективной лекарственной терапии; 2)определения механизмов резистентности к действию отдельных ЛП прионкомутацияхи3)определениюкомбинацийЛПдляпреодолениялекарственной резистентности при онкомутациях.Для исследования чувствительности PI3K/PTEN/AKT сигнальной системык кинетическим параметрам белков были применены методы локального иглобального анализа чувствительности и проведено сравнение их результатов(Lebedeva et al., 2012).В работе проведено дальнейшее развитие метода анализа чувствительностисигнальных систем для случая, когда система находится под действием ЛП иликомбинации лекарственных препаратов, а также на случай наличия мутацийбелков в сигнальной системе.
В работе проведено исследовано влияние ЛП навеличину чувствительности SAKT,pк кинетическим параметрам системы иуровням их экспрессии, которая была введена в разделе 3.3. (ур. (3.4)). Исходя итого, что чувствительность SAKT,pне может быть напрямую измеренаэкспериментально, в работе проанализирована связь SAKT,p с чувствительностьювыходного сигнала, pAKT, системы к ее входному сигналу, pHER2 , SAKT (ур. 3.1).Чувствительность SAKT напрямую связана с функцией отклика системы навходной сигнал и может быть непосредственно получена на основе анализаизменений функции отклика. В работе показано, что чувствительность SAKT,p иSAKT связаны: изменение SAKT,p происходит в области величин входного сигнала,где существенно изменяется чувствительность SAKT.На Рис. 7 приведены результаты расчета значений чувствительности SAKT,pи SAKT для PI3K/PTEN/AKT сигнального пути при действии пертузумаба и егокомбинации с ингибитором PI3K, LY2940002, для исходной системы и приналичии мутациий PTEN.
Показано, что ЛП, ингибирующий входной сигнал106системы, приводит к возрастанию чувствительности сигнальной системы как квходному сигналу (рост SAKT), так и к параметрам сигнальной системы (ростSAKT,p) . На основе полученных данных в работе обсуждается возрастаниечувствительности сигнальной системы к кинетическим параметрам белков и ихуровням экспрессии как одна из возможных причин активации компенсаторныхмеханизмов сигнальной системы в результате действия лекарственныхпрепаратов.Рис. 3-12. Влияние лекарственных препаратов и мутаций белков начувствительность PI3K/PTEN/AKT сигнальной системы SAKT и SAKT,p . Колонки1-4 показывают, соответственно, значения чувствительности pAKT сигналадля исходной системы, при действии пертузумаба (+2C4), при 50% потереактивности PTEN (PTEN(-)) и при действии пертузумаба и мутации PTEN(PTEN(-), +2C4). Колонки 5-8 показывают, соответственно, значениячувствительности pAKT сигнала при дополнительном действии ингибитораPI3K, LY294002.
Расчет проведен для чувствительности к параметру k31,расчеты для других параметров системы дали аналогичные результаты.107Проведенные расчеты влияния мутаций в системе на ее чувствительностьпоказали, что мутации гена PTEN, вызывающие уменьшение фосфатазнойактивности PTEN, приводят к потере чувствительности как к входному сигналу,(SAKT), так и к изменению параметров белков системы SAKT,p (Рис. 3-12, колонка3).
При этом в системе наблюдается максимальная активность AKT, которая нечувствительна к ингибированию входного сигнала при действии ингибитора:пертузумаб не влияет как на выходной сигнал, так и на чувствительностьсистемы (Рис. 3-12, колонка 4).Таким образом, система под действием ингибитора внешнего сигналапроявляют повышенную чувствительность к мутациям, приводящим крезистентности по отношению к действию данного ингибитора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
