Диссертация (1097599), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Для калибровки модели была выбрана клеточная линииPE04, для которой отсутствуют мутации в генах, кодирующих ErbB рецепторы исигнальные белки в PI3K/PTEN/AKT сигнальном пути (Cooke et al., 2010) (см.Таблицу 2-2).Для моделирования действия ЛП на клеточные линий сонкомутациями в PI3K/PTEN/AKT пути в разработанной модели изменялиськинетические параметры и концентрации тех сигнальных белков, в генахкоторыхобнаруженыонкомутации.Экспериментальныеработыбыливыполнены участниками проекта в Центре исследования рака Эдинбургскогоуниверситета. В экспериментах измерялась кинетика фосфорилированияосновных сигнальных белков в PI3K/PTEN/AKT пути клеточной линии ракаяичников PE04 в течении 1 часа после добавления в клеточную популяциюлиганда HRG в отсутствии и присутствии ингибиторов.
Методом Вестернблоттинга были измереныконцентрации следующих белков: рецептораErbB2(Tyr877), киназы pAKT(Ser473), фосфатазы pPTEN и киназы pERK(Faratian et al., 2009).В результате фиттирования экспериментальных данных был получен набор67AВДБГЕРис. 2-12. Результаты компьютерного моделирования кинетики активациии ингибирования PI3K/PTEN/AKT сигнального пути в опухолевой линии PEO4клеток яичников. Кинетика pErbB2 (A), pPI3K (Б), pAKT (В) и PIP2 (Г) приактивации HRG () и ингибировании ЛП пертузумабом (2C4) ().Результаты моделирования действия ЛП пертузумаба при ингибированииактивности PTEN (50 nM bpV(pic)) на кинетику pAKT (Д) и PIP2 (Е). Точки экспериментальные данные для pErbB2(Tyr877), pAKT(Ser437) при 1 нM HRG(черные точки), 100 нМ пертузумаба (синие точки) и 100 нМ пертузумабапри 50 нM bpV(pic) (синие точки на Рис.
2-12Г).68кинетических параметров модели, при котором модель наилучшим образомописывает кинетику активации сигнальной системы. Результаты расчетовкинетики фосфорилирования рецептора ErbB2, (pErbB2), AKT киназы (pAKT),PI3K (pPI3K) и кинетики PIP2 (фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата) вместе сэкспериментальными данными приведены на Рис. 2-12.Анализ полученных результатов показал, что модель удовлетворительноописывает динамику PI3K/PTEN/AKT сигнальной системы при активации ErbBрецепторов лигандом HRG. В модели рассмотрен одним из основных миогенныхмеханизмов активации PI3K/PTEN/AKT пути пролиферации раковых клеток засчет образования активированного лиганд-рецепторного комплекса ErbB3-HRGс рецептором ErbB2 (Yarden & Sliwkowski, 2001).
В результате формированияErbB3/ErbB2 комплексов происходит фосфорилирование тирозиновых остатковErbB3/ErbB2 рецептов, что вызывает связывание p85 регуляторной субъединицыPI3K киназы и фосфорилирование ее каталитической субъединицы p100. Врасчете этот процесс соответствует возрастании концентрации фосфо-PI3K,pPI3K (Рис.2-12) и синтезу PIP3.
Как видно, активация рецептора ErbB2 икиназы AKT происходит в течение первых 5 мин. после действия начальногостимула – добавления лиганда HRG (Рис. 2-12Б).Анализ полученных результатов показал, что пертузумаб являетсяэффективным ингибитором активации AKT сигнала. Его связывание с ErbB2рецептором приводит к ингибированию 70% и 90% фосфорилирования ErbB2 на5 мин и 60 мин, соответственно, после начала действия ингибитора. Этоприводит к подавлению активации PI3K киназы, низкому уровню синтеза PIP3и, как следствие, к ингибированию активации AKT сигнала.Как видно,пертузумаб вызывает, соответственно, 50% и 80% ингибирование pAKTконцентрации на 10 мин и 60 мин после начала действия ингибитора,соответственно.В моделирования показано, что основным управляющим элементом в69данной системе является цикл PIP2/PIP3, в котором синтезируется PIP3(фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат) – сигнальных липид, участвующий вначальной стадии активации AKT (Рис.
2-1).Этот цикл находится подуправлением киназы PI3K и фосфатазы PTEN – белков, для которых обнаруженавысокая частота мутаций в различных типах раковых опухолей. МутацииPIK3CA гена вызывают повышение активности киназы, в то время как мутацииPTEN гена приводят к делеции или пониженной фосфатазой активность PTEN.С целью выяснения влияния мутаций генов PIK3CA и PTEN на действиеингибиторов рецепторов был исследован ответ сигнальной системы приингибированиирецепторногосигналаприразличныхконцентрацияхсигнальных белков.
Показано, что при высоком уровне экспрессии PTENпертузумаб ингибирует активацию рецепторного сигнала pErbB2, что вызываетэффективное ингибирование выходного сигнала системы pAKT (Рис. 2-12). Приуменьшении экспрессии PTEN более чем на 50% ингибирование рErbB2рецепторов не вызывает ингибирование pAKT в области физиологическихконцентраций пертузумаба 100 нМ (Рис. 2-12).Таким образом в результате анализа теоретических результатов предложенмеханизм возникновения резистентности PI3K/PTEN/AKT сигнального пути кдействию ЛП пертузумаба, ингибирующего активацию ErbB3 рецепторов. Врезультате уменьшения активности фосфатазы PTEN выходной сигналPI3K/PTEN/AKT сигнального пути становиться нечувствительным к действиюлекарств, ингибирующих сигналы ErbB рецепторов. С целью проверкипредложенного механизма резистентности к моноклональной лекарственнойтерапии были спланированы эксперименты на клеточных линиях рака яичников,которые были проведены участниками проекта в Центре исследования ракаЭдинбургского университета (Faratian et al., 2009).702.5.
ИсследованиюмеханизмоврезистентностиPI3K/PTEN/AKTсигнальной системы к действию ингибитора клеточных рецепторовС целью проверки предложенного механизма резистентности к ЛПпертузумабубыли проведены эксперименты на клеточных линиях ракаяичников PE04. Цель экспериментов состояла в выяснении роли уровняэкспрессии PTEN фосфатазы в возникновении резистентности в раковых клетокк действию ингибитора ErbB3 рецепторов (Faratian et al., 2009). В проведенныхэкспериментах потеря активности PTEN вызывалась путем его ингибированияспецифическим ингибитором bpV(pic) (Vlahos et al., 1994). Проводилисьизмерения концентрации фосфорилирванной киназы pAKT(Ser473) и уровняингибирования роста клеточной популяции при действии пертузумаба.Рис. 2-13.
Сравнение теоретических результатов (темные столбцы) сэкспериментальными данными (светлые столбцы) по ингибирующемудействию пертузумаба. Активация pAKT на 30 минуте после добавления1 нМ HRG (столбец 1); ингибирование pAKT при действии пертузумаба(столбец 3). Отсутствие ингибирующего эффекта пертузумаба приингибировании активности PTEN при действии 50 нM bpV(pic) (столбец4).Экспериментальные результаты подтвердили предсказания модели попотере чувствительности выходного сигнала системы pAKT(Ser473) кингибированию входного рецепторного сигнала.
На Рис. 2-12Д представленосравнение теоретических и экспериментальных результатов кинетики, которое71показывает, что уровень pAKT(Ser473) сигнала остается высоким и не зависитот 90% ингибирования ErbB рецепторов пертузумабом при ингибированииактивностифосфатазыPTEN.НаРис.2-13приведеносравнениеэкспериментальных и теоретических уровней фосфорилированной киназыpAKT(Ser473).
Видно, что пертузумаб ингибирует начальную активацииAKT(Ser473) (столбец 1) на уровне 90%-80% (столбец 2). Ингибирование PTENне оказывает влияния на активации AKT(Ser473) (столбец 3), но приводит кподавлению ингибирующего эффекта пертузумаба (столбец 4).Расчеты также показали, что система теряет чувствительность кингибированию ErbB рецепторов при увеличении активности киназы PI3K (>2раз), а также при увеличении активности AKT киназы. Эти результаты будетприведены и проанализированы в главе 3.Таким образом, результаты проведенных совместных теоретических иэкспериментальных исследований показали, что изменения активностей киназPI3K, AKT и фосфатазы PTEN вызывают резистентность к ингибированиюErbB2,3 рецепторов. Анализ полученных результатов показал, что измененияактивностей указанных белков приводят к нарушению функционированияосновного управляющим элемента системы цикла PIP2/PIP3, приводящему кповышенному уровню сигнального липида PIP3.
В результате данногонарушения происходит потеря чувствительности всей сигнальной системыPI3K/PTEN/AKT к действию ингибиторов клеточных рецепторов. Далее в работепредполагается, что исследованное изменение активностей указанных белков,может происходить в раковых клетках при мутациях генов, кодирующих данныебелки. Изменение соотношения активностей белков при мутациях приводит кнарушению баланса в цикле PIP2/PIP3 и, как следствие, к возникновениюрезистентности к рецепторному сигналу.
Для всех трех исследованных белковобнаружена высокая частота мутаций в онкологии молочной железы и яичников(около 30%) (Yuan & Cantley, 2008). Мутации PIK3CA гена вызывают повышение72активности киназы, в то время как мутации PTEN гена приводят к делеции илипониженной фосфатазой активность PTEN. Повышенная активность AKT враковых клетках связана, главным образом, с амплификацией гена AKT.С целью проверки предсказаний модели по влиянию активностей белковPI3K, PTEN и AKT на возникновение резистентности сигнальной системыPI3K/PTEN/AKT с при онкомутациях были спланированы эксперименты насерии клеточных линий рака яичников с различными наборомами мутаций вгенах,кодирующихуказанныебелки.Былоприведеноизмерениеингибирующего действия пертузумаба на роста клеточных популяций 13 линийрака яичников с одновременным выполнением генетического и протеомногоанализа для определения мутаций PIK3CA гена и уровней экспрессии ErbBрецепторов и белков, входящих в PI3K/PTEN/AKT сигнальный путь.Спланированные эксперименты были проведены участниками проекта в ЦентреИсследования Рака Эдинбургского университета (Faratian et al., 2009).2.6.
Анализ экспериментальных и клинических данных по проверкемеханизмов резистентности к ингибиторам клеточных рецепторовС целью проверки предложенного механизма резистентности былипроанализированы данные экспериментов, проведенных на клеточных линияхрака яичников с различным набором мутаций.
В экспериментах было проведеноизмерение степени ингибирования роста популяций 13 клеточных линий придействии пертузумаба, а также были определено наличие мутаций PIK3CA генаи измерены уровни экспрессии ErbB1, ErbB2 и ErbB3 рецепторов и белков PTEN,AKT, pAKT, ERK и pERK. Экспериментальные данные приведены на Рис. 2-14.Как показали результаты анализа экспериментальных данных, резистентность кингибитору пертузумабу (ингибирование <15%) наблюдается у клеточныхлинии с низким уровнем экспрессии PTEN, повышенным уровнем экспрессии73AKT, pAKT, ERK и pERK, а также с мутациями PIK3CA (левая часть верхней инижней диаграмм на Рис.
2-14). В то время как клетки с высоким уровнемэкспрессиииPTENчувствительностькнизкимидействиюуровнямиAKTпертузумабаииpAKTпроявляютингибирующийэффектпертузумаба для них достигает 40%.Рис.2-14.Экспериментальныеданныепоингибирующемедействиюпертузумаба на рост 13 линий раковых клеток яичников (верхняя диаграмма) иуровням экспрессии ErbB рецептором и основных белков в PI3K/PTEN/AKTсигнальном пути, а также мутации PIK3CA гена в исследуемых клетках(нижняя диаграмма).Для клинической проверки полученных результатов были собраны ипроанализированы клинические данные для пациентов с раком молочной железы,проходящих курс моноклональной терапии в Western General HospitalЭдинбургского университета. В проведенных клинических исследованиях былиспользован препарат трастузумаб (Герцептином), который аналогичнопертузумабу является ингибитором ErbB2 рецепторов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
