Диссертация (1097599), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Точки – экспериментальные данные для PI3Kα: 10μM PIP2, 10 nM PI3Kα в эксперименте, реакции были остановлены на 60мин (Maira et al., 2008).2.3.2. Кинетическая модель mTOR1 комплекса и действия ингибитороврамамицина и BEZ235.В данном разделе приводится модель mTOR1 киназного комплекса. Вработе разработан каталитический цикл mTOR киназы, который включаетфосфорилирование S6K1 и 4EBP1 киназ (Рис. 2-8).
Также в каталитическом53цикле рассмотрено действие аллостерического ингибитора рапамицина (Rap) иATP-конкурентных ингибиторов BEZ235 и LY294002. При моделированииингибирующего действия рапамицина былиРис. 2.8. Каталитический цикл mTOR киназы аллостерическогоингибитора рапамицина (Rap) и ATP-конкурентных ингибиторов BEZ235и LY294002 (Inh).учтены следующие экспериментальные данные. Рапамицин слабо связывается сFRB доменом mTOR-киназы (FKBP-rapamycin binding domain) (26 μM(Banaszynski, Liu, & Wandless, 2005)).
Его сродство увеличивается в присутствииFKBP12 белка FK506-binding protein 12). За счет низкой константы диссоциации54рапамицина с FKBP12 белком (0.2 nM (Banaszynski et al., 2005)), он связываетсяс mTOR-киназой через образование тройного комплекса FKBP12-RapamycinFRB с константой диссоциации 12±0.8 nM (Banaszynski et al., 2005). Вкаталитическом цикле этот механизм учтен за счет включения двух реакцийсвязывания,идущихвотсутствиииприсутствиисоответствующим константами диссоциации Kd,Rap1 andFKBP12белка,сKd,Rap2.
Также былоучтено, что при связывании рапамицина или комплекса рапамицин-FKBPmTOR-киназа сохраняет остаточную каталитическую активность в реакциифосфорилирования 4EBP1 и полностью ее теряет по отношению к киназе S6K1(Choo, Yoon, Kim, Roux, & Blenis, 2008; Tao, Barker, Shi, Gehring, & Sun, 2010;Toral-Barza et al., 2005).В соответствии с разработанным каталитическим циклом было полученоуравнение для скоростей реакций с использованием приближения случайногосвязывания субстратов для двух-субстратной ферментативной реакции впредположении быстрого связывания субстратов (ATP, S6K1 и 4EBP1) (CornishBowden, 2004).Уравнения скоростей реакций фосфорилирования субстратов 4EBP1, V4EBP1,и S6K1, VS6K1 в присутствии аллостерического ингибитора рапамицина и ATPконкурентных ингибиторов BEZ235 и LY294002 имеют следующий вид41 =41 ∙ 1 ∙ 41 ∙ (1 + 41 ⋅ ),41 ⋅ , ∙ ∆61 =где∆ = (1 +61 ∙ 1 ∙ 61 ∙ ,,61 ⋅ , ∙ ∆(2.7)(2.8)4161+++) (1 +) (1 + ),, , ,,41 ,6155=Здесь Kd,i_+.,1,2- константы диссоциации субстратовATP, 4EBP1, S6K1 иингибиторов рапамицина (Rap), BEZ235 (BEZ) и LY294002 (LY).
k4EBP1 и kS6K1 скорости каталитических реакций. Параметр η4EBP1=k4EBP1,Rap/k4EBP1 – отношениескоростей реакции фосфорилирования 4EBP1 mTOR-киназой в присутствии иотсутствиирапамицина,которыйопределяетстепеньингибированиякаталитической активности киназы mTOR рапамицином. Отметим, чтоуравнения (2.7) и (2.8) описывают конкурентную кинетику двух субстратов,4EBP1 и S6K1, катализируемых одним ферментом mTOR1, что соответствуетдвух-субстратной реакции фосфорилирования, катализируемой mTOR1 киназойв клетке.Для определения кинетических параметров, входящих в уравнения (2.7) и(2.8) были использованы in vitro экспериментальные данные для реакцийфосфорилирования 4EBP1(Thr46) и S6K1(Thr389) киназ, катализируемых mTORкиназой (Tao et al., 2010; Toral-Barza et al., 2005). Процедура фиттированиямодели была реализована на основе набора экспериментальных данных, которыйвключал зависимости скорости реакции V4EBP1 (уравнение (2.7) от ATP и 4EBP1и концентраций, измеренные при различных концентрациях рапамицина (Tao etal., 2010).
Результаты фиттирования экспериментальных данных показаны наРис. 2-9А и Б. В Таблице 2-5 приведен набор полученных кинетическихпараметров с указанием доверительных интервалов (в скобках), рассчитанныхбутсрапинг методом (см. Приложение 1).В соответствии с полученными результатами mTOR киназа сохраняет около40% своей активности при связывании с ингибитором рапамицином: константаскорости k4EBP1 уменьшается на фактор η4EBP1=0.43 (0.38; 0.44). Это видно поостаточному уровню активностина Рис.2-9С. Найденная константадиссоциации Kd,Rap2=6 нM (3.1; 6.9) близка к экспериментальному значению5612±4.2нMдлятройногокомплексаFKBP12-рапамицин-FRB-домен,измеренному методом поверхностного плазмонного резонанса (Banaszynski etal., 2005).Рис.2-9.(A):Зависимостьскоростиреакции4EBP1(Thr46)фосфорилирования, катализируемой mTOR киназой, от концентрации ATPпри разных значениях концентрации рапамицина: линия 1 0 нM, линия 2 – 8нM, линия 3 – 20 нM, линия 4 – 128 нM.
Точки – экспериментальные данные:200 нM 4EBP1, 3 нM mTOR, 200 нM FKBP12 в TR-FRET эксперименте (Taoetal., 2010). (B):Зависимость скорости реакции 4EBP1(Thr46)фосфорилирования от концентрации субстрата 4EBP1. Линия –теоретическая зависимость. Точки – экспериментальные данные: 300 μMATP, 6.7 нM mTOR в радиометрическом эксперименте (Tao et al., 2010). (C):Дозовая зависимость скорости реакции mTOR1 от концентрациирапамицина (линия 1) и BEZ235 (линия 2). Линии терутичесеи зависимости.Тички - экспериментальные данные: 40 μM 4EBP1, 20 нM mTOR1 и 100 μMATP в радиометрическом эксперименте (Tao et al., 2010).57Значение константы диссоциации ATP, Kd,ATP =8.4 M (6.2; , з8.9),полученное в расчете, значительно ниже, чем значение константы Михаэлиса, 74μM, полученное в работе (Tao et al., 2010) на основе фиттированияэкспериментальных данных уравнением Михаэлиса-Ментен. Можно назвать двевозможные причины этого различия.
Первая причина может быть за счет того,что данный расчет проведен на более широком наборе экспериментальныхданных, чем расчет (Tao et al., 2010), в результате чего получена более надежнаяоценка для этой константы. Вторая причина может быть связана с тем, что вданном расчете определялась истинная константа диссоциации, в то время как вработе (Tao et al., 2010) была найдена кажущаяся константа Михаэлиса.С целью валидации модели с набором полученных кинетическихпараметров был проведен расчет зависимость скорости реакции mTOR1 отконцентрациирапамицина(ур.экспериментальными данными(2.7))ипроведеносравнениес(Tao et al., 2010).
Сравнение показалоудовлетворительное согласие расчета с экспериментом (Рис. 2-9С, линия 1).Также было проведено сравнение расчетной дозовой зависимости активностиmTOR1 (скорости реакции) от концентрации ингибитораBEZ235 сэкспериментальными данными (Tao et al., 2010), что также показалоудовлетворительное согласие теории с экспериментом (Рис. 2-9С, линия 2).При сопоставлении дозовых зависимостей для рапамицина и BEZ235 наРис.2-9С, (линии 1 и 2) видно, что рапамицин ингибирует около 60%активности mTOR1 в то время как BEZ235 подавляет ее полностью. В результатефиттинга модели по экспериментальным данным для дозовых зависимостейактивности mTOR1 (скорости реакции) от концентрации ингибитора BEZ235была оценена константа диссоциации для BEZ235 Kd,BEZ=0.56 nM (0.48; 0.57),значениекоторойниже,чемэкспериментальныезначенияконстантингибирования Km=2.5 нM и 1.7 нM, полученные в результате фиттингарадиометрических и FRET экспериментальных данных в работе (Tao et al., 2010).58Полученное значение константы диссоциации Kd,BEZ позволяет оценитьзначения IC50 для различных значений концентрации ATP, использованных вэксперименте:(2.9)).,Уравнение (2-5) следует из уравнения (2-1) и определения IC50 как значения50 = , (1 +концентрации ингиибитора, при которой достигается 50% ингибированиеактивности фермента.
Вывод уравнения (2.9) дан в Приложении 1. Дляконцентрации ATP=100 μM уравнение (2.9) дает значение IC50 = 8 μM, что близкок экспериментальному значению IC50 = 10 nM, полученному на основе дозовойзависимости (Tao et al., 2010) (см. экспериментальные данные на Рис. 2-9С).Таким образом соотношение (2.9) позволяет оценить IC50 значения дляингибитора BEZ235 для различных экспериментальных условий и дляразличныхклеток,используяизвестныезначениявнутриклеточнойконцентрации ATP.В противоположность зависимости значения IC50 от концентрации ATP дляATP-конкурентного ингибитора, значение IC50 для аллостерического ингибиторарапамицина не зависит от концентрации ATP и в соответствии с уравнением (2.7)равняется константе диссоциации рапимицина:где ,50 = , ,(2.10)– константа диссоциации либо ,1 или ,2 в зависимости отприсутствия или отсутствия FKBP12 белка в эксперименте.
Это точноеравенство (2.10)59Рис. 2-10. (A): Зависимость скорости реакции S6K1(Thr389)фосфорилирования, катализируемой mTOR киназой, от концентрацииATP при разных значениях концентрации ингибитора LY294002: линия 1 0 нM, линия 2 – 0.8 μM, линия 3 - 1.6 μM и линия 4 - 3.2 μM LY294002. Точки– экспериментальные данные: 1.25 μM S6K1, ATP 100 μM, 6 nM FLAGTOR в эксперименте (Toral-Barza et al., 2005).
(B): Дозовая зависимостьскорости реакции mTOR1 от концентрации рапамицина в присутствии(линия 1) и отсутствии (линия 2) FKBP12 белка. Линии –теоретическиерезультаты. Точки - экспериментальные данные: кружки и треугольники(Toral-Barza et al., 2005) и квадраты (Shor et al., 2008).Экспериментальные условия: 1.25 μM S6K1, 6 нM FLAG-TOR. (C): ДозоваязависимостьингибированияFLAG-mTOR1скоростиреакциифосфорилирования S6K1(Thr389) инигиибитором LY294002.
Линии 1 и 2 –теоретические расчеты при 100 μM и 2 μM ATP, соответственно. Точки– экспериментальные данные при 1.25 μM S6K1, 100 μM ATP, 6 нM FLAGTOR(3.5) в эксперименте (Toral-Barza et al., 2005). Линия 3 –теоретиическая дозовая зависимость ингибирования активности mTORкомбинацией ингиибиторов LY294002 и рапамицина (10 нM) при 100 μMATP.следует из уравнения для скорости реакции 41 (2.7) и определения значенияIC50. Вывод соотношения (2.10) приведен в Приложении 1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
