Диссертация (1097599), страница 8
Текст из файла (страница 8)
В частности, модели используются для расчета и сравненияс экспериментом дозовых активностей ферментов при различных концентрацияхсубстратов и зависимостей IC50 для ЛП от концентраций субстратов.Разработанный метод был успешно применен для описания сложной кинетикиразличных ферментов, функционирующих в разных сигнальных системах45клетки и результаты моделирования были опубликованы в следующих работах(Goltsov et al., 2009, 2010, 2015; Goltsov, Tashkandi, Langdon, Harrison, & Bown,2017; Sokolovski et al., 2013).Разработанные модели сигнальных белков использованы в полной моделисигнальныхсистемпредсказательнойэкспериментальныеклеткиспособностиданныесцельюзапосчётповышенияееиспользованияингибированиюнадежностиимногочисленныесигнальныхбелковлекарственными препаратами, полученных вРис.
2-4. Схема метода разработки кинетических моделей отдельныхсигнальных белков. Метод включает разработку каталитического циклафермента, дискриминацию механизмов действия ингибиторов икалибровку модели на основе набора экспериментальных данных.Разработанные модели используются для определения значенийкинетических параметров ферментов и оценки значенийIC50ингибиторов для различных экспериментальных условий.экспериментах на очищенных белках. Тестирование моделей при различныхконцентрациях субстратов и ингибиторов позволяет повысить надежностьиспользования моделей отдельных белков при клеточных концентрацияхсубстратов, отличающихся, в общем случае, от концентраций в экспериментах46на очищенных белках.
Сравнение действия лекарств на клеточном уровне сданными, полученными на отдельных белках, выделенных из клеточногоэкстракта, позволяет анализировать системные эффекты, влияющие наэффективность действия ЛП на клеточном уровне. В частности, в работеанализируется потеря эффективности действия ЛП на уровне полной сигнальнойсистемы при сохранении его действия на белок-мишень. Также разработанныемодели могут быть использованы при испытаниях новых ЛП и оценки значенийих IC50 в различных экспериментальных условиях функционирования фермента.Кинетические параметры моделей были определены в результатенаилучшего описания наборов экспериментальных данных с использованиемметодов оптимизации в среде Matlab (MathWorks Inc.).Для оценки точности кинетических параметров протеин-киназ, полученныхв разработанных моделях, был применен статистических метод бутстрепинга(bootstraping method) (Draper & Smith, 2014; Efron & Tibshirani, 1994).
Расчетадоверительных интервалов для полученных кинетических параметров былвыполнен с использованием процедуры бутстрап-выборки (ресамплинга).Краткое изложение метода приведено в Приложении 1.2.3.1. Кинетическая модель PI3K киназы и действия ее ингибиторовВ данном разделе приводятся результаты по кинетическому моделированиюфункционирования PI3K киназы и действия ее ингибиторов, BEZ235 и LY294002,исследованные в работе.
Разработанная модель каталитического цикла PI3Kкиназывключаетреакциюфосфорилированияфосфатидилинозитол-4,5-дифосфата (PIP2) и образование продукта фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат(PIP3) (Рис. 2-5). Каталитический цикл также учитывает действие ATPконкурентных ингибиторов BEZ235 и LY294002.47Рис. 2-5. Каталитический цикл киназы PI3K с учетом ATP-конкурентныхингибиторов BEZ235 и LY294002.В соответствии с разработанным каталитическим циклом было полученоуравнение для скорости реакций в приближения случайного связываниясубстратов, ATP и PIP2,для двух-субстратной ферментативной реакции впредположении быстрого связывания субстратов (Cornish-Bowden, 2004).3 =где∆3 = (1 +3 ∙ 3 ∙ 2 ∙ ,,2 ⋅ , ∙ ∆3(2.3)2++) (1 +).,2, , ,Кинетические параметры PI3K киназы были определены в результатефиттированиязависимостискоростиреакцииVPI3K(ур.(2.3))поэкспериментальным данным (Huang et al., 2011; Vlahos, Matter, Hui, & Brown,1994).
На Рис. 2-6 представлены результаты фиттирования зависимости скоростиреакции VPI3K (ур. (2-3)) от концентрации субстрата PIP2 в присутствии иотсутствии ингибитора LY294002.48Рис.2-6. (A): Зависимость скорости реакции PI3K киназы от ATPконцентрации.Линии-теоретическиезависимости.Точки–экспериментальные данные: 2 μM PIP2 в эксперименте (Huang et al., 2011).(B): Зависимость скорости реакции PI3K киназы от PIP2 концентрации.Точки – экспериментальные данные: 2 mM ATP в эксперименте (Huang etal., 2011). (C): Графика Лайнвивера -Берка для скорости реакции PI3K дляразличных концентраций ингибитора LY294002: линия 1 - 0 μM, линия 2 - 1μM, линия 3 - 5μM,линия 4 - 10 Μ и линия 5 - 20 μM LY294002. Точки –экспериментальные данные: 400 μM PIP2 в эксперименте (Vlahos et al.,1994).
(D): Дозовая зависимость накопления продукта реакции ADP отконцентрации ингибиторов BEZ235 (линия 1) и LY294002 (линия 2). Точки –экспериментальные данные для PI3Kα (p85/p110α) изоформы: 20 μATP, 10μM PIP2, 0.4 μg/mL PI3Kα в эксперименте (Maira et al., 2008).49Таблица 2-4. Кинетические параметры PI3K киназы и ее ингибиторов, BEZ235 иLY294002. Указаны значения медиан и в скобках даны доверительныеинтервалы, полученные методом бутстрапинга. Приведены такжеэкспериментальные данные, полученные на очищенном ферменте. Km и Kiконстанты Михаэлиса и ингибирования.Кинетические параметрыЭкспериментальные данныеМаксимальная скорость реакции, Vmax160 pmol/g/min (54; 200)Константа диссоциации ATP, Kd,ATP30.3 μM (27.1; 85.1)Km= 24±4.2 μM (Huang et al., 2011)Константа диссоциации PIP2, Kd,PIP270.3 μM (27.1; 85.1)Km=68.7±5.2 μM (Huang et al., 2011)Константа диссоциации LY294002, Kd,LY0.6 μM (0.3; 0.7)Ki=1.6 μM (Vlahos et al., 1994)1)0.21 μM (0.18; 0.24),IC50=1.43 μM p85/p110α (Huang et al.,(p85/p110α)2011)2)0.19 μM (0.16; 0.22),IC50=1 μM p85/p110α (Maira et al., 2008)(p85/p110α)IC50=0.186 μM p110α (Gharbi et al.,2007)Kd,LY=0.21±0.04 μM, PI3K (Walker et al.,2000)Константа диссоциации BEZ235, Kd,BEZ1.6 nM3) (1.2; 2.1)IC50=5±4 nM, p110 (Maira et al., 2008)(p85/p110α)IC50=4±2 nM, p110α (Maira et al., 2008)4)0.50 nM (0.45; 0.51)IC50=75±45 nM, p110 (Maira et al., 2008)(p85/p110α)IC50=7±6 nM, p110 (Maira et al., 2008)1),3)Эти оценки получены при фиттировании экспериментальных данных,измеренных MaxiSorpTM эксперименте (Maira et al., 2008)2),4)Эти оценки получены при фиттировании экспериментальных данных поизмерению ADP концентрации (Maira et al., 2008).Линейная зависимость скорости реакции в обратных координатах графикаЛайнвивера-БеркаподтверждаетATP-конкурентныймеханизмдействияингибитора LY294002 (Рис.
2-6). Полученные кинетические параметрыприведены в Таблице 2-4.50ДляоценкиконстантыдиссоциацииингибитораBEZ235былииспользованы экспериментальные данные по дозовой зависимости накопленияпродукта реакции ADP от концентрации BEZ235 для PI3K изоформы (Maira etal., 2008). Кинетики ADP была рассчитана путем решения кинетическогоуравнения с начальными условиями, соответствующими экспериментальнымусловиям:(2.4)= 3 ,где скорость реакции VPI3K определяется уравнением (2-3). В результатенаилучшего согласия с экспериментальными данными (Рис. 2-6D)былаопределена константа диссоциации для ингибитора BEZ235 Kd,BEZ=1.6 nM (1.2;2.1) (Таблица 2-4).
Для оценки константы диссоциации ингибитора LY294002были также использованы экспериментальные данные по дозовой зависимостинакопления продукта реакции ADP от концентрации ингибитора для PI3Kизоформы (Maira et al., 2008). Сравнение дозовых зависимостей для BEZ235 иLY294002 показано на Рис. 2-6D. Константа диссоциации ингибитора LY294002,полученная в расчете Kd,LY=0.21 M CI(0.18; 0.24), ниже значения Kd,LY=0.6 MCI(0.3; 0.7), полученного в предыдущем расчетедля PI3K киназы,изолированной из клеток мозга быка, и близка к экспериментальной константедиссоциации Kd,LY =0.21±0.04 M, полученной для PI3K изоформы в работе(Walker et al., 2000) (Таблица 2-4).С целью проверки надежности полученной модели PI3K (ур. (2.3)) былипроведены расчеты зависимости значения IC50 для BEZ235 и LY294002 отконцентрации ATP и выполнено сравнение с экспериментальными данными дляPI3K изоформы (Maira et al., 2008).
Значение IC50 рассчитывалось для дозовойзависимости производства ADP от концентрации ингибитора. Теоретическаязависимость значения IC50 от начальной концентрации ATP0 была получена наоснове аналитического решения ур. (2-4) в следующем виде5150где0 (− 0 )= ,−1 ,012 ( (1 +20 ))()(2.5)−13 ∙ 3 ∙ 22=(1 +) .,2 ⋅ ,,2Здесь 0 = ( , = 0) - конечная концентрация ATPпри остановкереакции в момент времени в отсутствии ингибитора, полученная прирешении уравения (2.4). Вывод соотношения (2.5) приведен в Приложении 1.Полученное уравнение (2.5) позволяет рассчитывать зависимость IC50 отначальной концентрации 0 на основе решениия уравнения (2.4) ( , =0) = 0 − ( , = 0) при нулевой концентрации ингибитора = 0 .Отметим, что полученное соотношение (2.5) не требует расчетов дозовыхзависимостейдля различных концентраций ATP и численного рачетасоответствующих значений 50 .Уравнение (2.5) было использовано для расчетов зависимостей значений50 для ингибиторов BEZ235 и LY294002 от концентрации 0 в модели сначальными значениями, соответствующими экспериментальным условиямработы (Maira et al., 2008).
На Рис. 2.7А,В проведено сравнение полученныхзависимостей 50 для ингибиторов BEZ235 и LY294002 от концентрации 0с экспериментальными данными (Maira et al., 2008). Зависимость значения 50для ATP-конкурентного ингибитора от концентрации ATP также можнополучить на основе зависимости скорости реакции 3 (ур. (2-3) отконцентрации субстрата ATP в следующем виде50 = , (1 +).,(2.6)52Вывод соотношения (2.6) дан в Приложении 1. На Рис.
2-7 зависимость (2-5)приведена для сравнения с зависимостью (2-6). Совпадение двух зависимостейпозволяет оценить значение 50 при ATP=0 M. Согласно уравнению (2-6)значение 50 при ATP=0 M равно константе диссоциации , для данногоингибитора. Пересечение прямых для BEZ235 и LY294002 с осью Y дает, = 2 nM и , = 0.7 M, соответственно, что удовлетворительносогласуется с полученными в расчете константами диссоциации, приведеннымив Таблице 2-4.Рис. 2-7. Зависимости значений IC50 для BEZ235 (A) и LY294002 (B) для PI3Kкиназы от ATP концентрации, рассчитанные на основе дозовыхзависимостей производства ADP от концентрации ингибиторов. Линии –теоретические расчеты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
