Диссертация (1151508), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Отклонение концентрации при n=53 – 4,5%8.Диапазон измерений1,5 – 10 и более мкг/кг9.Предел обнаружения0,05 мкг/кг10. Калибровочная кривая линейна в диапазоне11. Расхождение результатов:ВГНКИ, ВНИИЗЖ,Отклон. Точности:1,1±0,1 мкг/кг0,15 – 1,35 мкг/кгНе более 10%ЦНМВЛВоспроизводимость (межоперационная точность) результатов измеренийобразцов с добавкой заведомо известного количества тетрациклина тремя110разными операторами в условиях одной лаборатории составляет, порядка,95,5%. Относительное стандартное отклонения концентрациипри п=3, свероятностью 0,95 составляет, 4,5%.3.
Диапазон измерений составляет 1,5 – 10 и более мкг/л (таблица 57)5. Предел количественного определения 1,5 мкг/л.6. Линейность.По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартныхрастворов,итетрациклинасоответствующимвмкг/кг(мкг/л)известнымстроитсязначениямконцентрациикалибровочнаякриваявполулогарифмической системе координат. При правильно проведенномопределении калибровочная кривая должна быть почти линейна в диапазонеОптическая плотность, %0,15 – 1,35 мкг/кг (схема 3).Схема 3 - Калибровочная кривая для набора реагентов Ridascreen®Тетрациклин7.
Межлабораторную воспроизводимость метода оценивалась в течениевсего срока работы набором Ridascreen®-Тетрациклин производства RBiopharm путем межлабораторных сравнительных испытаний с ФГУ111ВНИИЗЖ,ГНУВНИИВСГЭ.Расхождениямеждурезультатамиисследования образца с одним и тем же содержанием тетрациклина методомИФА с использованием набора Ridascreen®-Тетрациклин производства RBiofharm не превышала 10,0%.2.12.2. Валидация метода определения остаточного содержанияантибиотиковтетрациклиновойвысокоэффективнойжидкостнойгруппыспомощьюхроматографиисмасс-спектрометрическим детекторомВалидацию методики проводили по ГОСТ Р 53601-2009. Продуктыпищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточногосодержанияантибиотиковтетрациклиновойгруппыспомощьювысокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическимдетектированием.Согласно требованиям стандарта ISO 17025 все методы испытания,используемые в лабораториях, должны быть валидированы и утверждены.Валидация методов выполняется для того, чтобы достичь требуемыххарактеристик типа точности, прецизионности и правильности результатовиспытания.Настоящая валидация распространяется на мясо и устанавливает методидентификации и количественного определения остаточного содержанияантибиотиков тетрациклиновой группы.
Метод основан на экстракцииантибиотиков тетрациклиновой группы с помощью ЭДТА (Трилон Б) нафосфатноцитратном буфере из гомогенизированной массы анализируемогообразца.Очисткаэкстрактовосуществляетсяметодомколоночнойтвердофазной экстракции с сорбентом типа С18.Измерение содержания тетрациклинов и их эпи-форм выполнялиметодом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-детектором112на хроматомасс-спектрометре «Agilent 1200 – LC-MS/MS API 5000» стандемным квадрупольным масс-анализатором. Детектирование аналитовпроводили в режиме мониторинга множественных реакций (MRM).Количественное определение проводили методом внутреннего стандартапоплощадипикаидентифицированныхсоединенийотносительнокалибровочной кривой, полученной при анализе в аналогичных условияхградуировочных растворов.В настоящей валидации использованы ссылки:ГОСТ Р 53601-2009 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Методопределения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновойгруппы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с массспектрометрическим детектором»LODLOQRPПДК— предел детектирования (Limit of Detection)— предел количественного определения (Limit of Quantitation)— процент возврата (Recovery Percent)— предельно допустимая концентрацияТаблица 57Стандартные образцы антибиотиков тетрациклиновой группы№ п/пАнтибиотик тетрациклиновой группыНомер стандартного образца1Демеклоциклина гидрохлоридSIGMA-ALDRICH, D61402Тетрациклина гидрохлоридSIGMA-ALDRICH, T40623Хлортетрациклина гидрохлоридSIGMA-ALDRICH, C48814Окситетрациклина гидрохлоридSIGMA-ALDRICH, O58755ДоксициклинSIGMA-ALDRICH, D9891Параметры настройки масс-спектрометрического детектораВ таблице 58 приведены параметры метода воздействия на ионы в режимемониторинга множественных реакций (MRM) и условиях электроспрея срегистрацией положительных ионов.113Таблица 58Массы регистрируемых ионов и время выходаАналитRT (min)Хлортетрациклин11.16Тетрациклин10.45Окситетрациклин10.27Доксициклин11.44Демеклоциклин10.80Q1 Mass(Da)Q2 Mass(Da)Dwell(msec)DPCECXP479.10444.102006030.530479.10462.102006025.030445.20410.002006025.030445.20427.102006019.230461.20426.102006028.030461.20443.202009621.036445.20428.102006024.030445.20410.2020012623.028465.10448.102006025.030465.10430.102006030.030Далее разрабатывали план валидации МУ 1538-2/23, ГОСТ Р 53601-2009 наопределение антибиотиков тетрациклиновой группы в мясе.В качестве объекта валидации использовали образец мяса (мяса птицызамороженный).Попредварительныманализамвданномобразцесодержание антибиотиков не обнаружено.
Процедура расчета содержанияантибиотиков проводили с использованием калибровочных графиков черезвнутренний стандарт (демеклоциклин).День первый, 08.02.2012г. (файл с результатами:2010208Val_myaso.rdb).Бланк матрицы (чистый образец мяса птицы).Калибровочные – образец мяса птицы с внесением растворов стандартныхобразцов, расчетное содержание антибиотиков в пробе: 1мкг/кг, 10мкг/кг,100мкг/кг, 250 мкг/кг, 500 мкг/кг.6 проб (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 5 мкг/кг.6 проб (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 10 мкг/кг.1146 проб (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 15 мкг/кг.1 проба (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 20 мкг/кг.1 проба (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание тетрациклинов в пробе 50 мкг/кг.День второй, 09.02.2012г.
(файл с результатами: 20120209Val_myaso.rdb).Бланк матрицы (чистый образец мяса птицы).Калибровочные – образец мяса птицы с внесением растворов стандартныхобразцов, расчетное содержание антибиотиков в пробе: 1мкг/кг, 10мкг/кг,100 мкг/кг, 250 мкг/кг, 500 мкг/кг.6 проб (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 5 мкг/кг.6 проб (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 10 мкг/кг.6 проб (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 15 мкг/кг.1 проба (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 20 мкг/кг.1 проба (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание тетрациклинов в пробе 50 мкг/кг.День третий, 10.02.2012г.
(файл с результатами: 20120210Val_myaso.rdb).Бланк матрицы (чистый образец мяса птицы).Калибровочные – образец мяса птицы с внесением растворов стандартныхобразцов, расчетное содержание антибиотиков в пробе: 1мкг/кг, 10мкг/кг,100 мкг/кг, 250 мкг/кг, 500 мкг/кг.6 проб (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 5 мкг/кг.1156 проб (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 10 мкг/кг.6 проб (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 15 мкг/кг.1 проба (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание антибиотиков в пробе 20 мкг/кг.1 проба (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание тетрациклинов в пробе 50 мкг/кг.День четвертый, 12.02.2012г.
(файл с результатами: 20120212Val_myaso.rdb)Бланк матрицы 10 проб (образец мяса птицы)10 проб (образец мяса птицы) с добавлением стандартов, расчетноесодержание тетрациклинов в пробе 1 мкг/кг.Калибровочные – образец мяса птицы с внесением растворов стандартныхобразцов, расчетное содержание антибиотиков в пробе: 1мкг/кг, 10мкг/кг,100 мкг/кг, 250 мкг/кг, 500 мкг/кг.4. Параметры и критерии валидации.Показатели валидации при определении тетрациклинов в продукцииживотноводства.Таблица 59Параметры валидацииСелективностьЛинейность++Пределдетектирования(LOD)Пределколичественногоопределения(LOQ)Точность(RP)Повторяемость(RSD r )Воспризводимость(RSDwR )+++++116Требования к параметрам методаКритерийПараметрыЛинейностьПределколичественногоопределения(LOQ)Таблица 60Сигнал должен быть пропорционален концентрации аналита.При этом рассчитывается уравнение регрессии.
Уравнениелинейной регрессии, примененное к результатам, должно иметьотрезок, отсекаемый на координатной оси, близкий к нулю.Коэффициент корреляции линейной регрессии должен быть неменее 0,98Посредством определения: самого низкого уровня, длякоторого было продемонстрировано соответствие критериямточности и прецизионности.Точность(RP)Ответная реакция вреагентномхолостомобразце иконтрольных образцах (<30% предела количественногоопределения).Определить средний коэффициент извлечения для обоихуровней обогащенияПовторяемость(RSD r )Определить RSD rповторяемости, определить для обоихуровней обогащенияСелективностьВоспроизводимость Определить воспроизводимость внутри лаборатории(RSDwR)Параметры метода, которые получены в результате валидацииПараметрыЛинейностьПределколичественногоопределения(LOQ)СпецифичностьТочностьПовторяемость(RSD r )Воспроизводимость(RSDwR)Таблица 61Соответствие критериямУравнение линейной регрессии, примененное к результатам, должноимеет отрезок, отсекаемый на координатной оси, близкий к нулю.Коэффициенткорреляции линейной регрессии для всехантибиотиков тетрациклиновой группы составил больше 0,99 .По всем антибиотикам тетрациклиновой группы для 1 мкг/кгпродемонстрировано соответствие критериямНе превышает 30%.Средний коэффициент извлечения для обоих уровней обогащениянаходится в пределахДанный параметр соответствует критериям для всех антибиотиковтетрациклиновой группыДанный параметр соответствует критериям для всех антибиотиковтетрациклиновой группы117Таблица 62Коэффициент корреляции (из приложения 1)Наименование антибиотикатетрациклиновой группыКоэффициент корреляцииТетрациклин (445.2/410.0 Da)Тетрациклин (445.2/427.1 Da)Хлортетрациклин (479.1/444.1 Da)Хлортетрациклин (479.1/462.1 Da)Окситетрациклин (461.2/426.1 Da)Окситетрациклин (461.2/443.2 Da)Доксициклин (445.2/428.1 Da)Доксициклин (445.2/410.2 Da)НаименованиеантибиотикатетрациклиновойгруппыТетрациклин(445.2/410.0 Da)Тетрациклин(445.2/427.1 Da)Хлортетрациклин(479.1/444.1 Da)Хлортетрациклин(479.1/462.1 Da)Окситетрациклин(461.2/426.1 Da)Окситетрациклин(461.2/443.2 Da)Доксициклин(445.2/428.1 Da)Доксициклин(445.2/410.2 Da)День 1День 2День 3День 41.000.990.990.990.991.001.001.000.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.990.99Таблица 63Предел количественного определенияПределколичественногоопределения, мкг/кгСоотношениеДень 1День 2День 3День 412.114.62.45.913.03.84.15.012.525.65.01.411.819.07.86.4113.155.519.36.417.04.07.96.717.76.77.411.817.87.07.66.1Таблица 64СпецифичностьНаименованиеантибиотика тетрациклиновойгруппыПределколичественногоопределения, мкг/кгОтветная реакцияхолостого образца,%Тетрациклин15Хлортетрациклин111Окситетрациклин19Доксициклин121118Таблица 65Средний коэффициент извлечения (из приложения 3)Наименование антибиотикатетрациклиновой группыСредний коэффициент извлечения, %1 уровень2 уровень3 уровеньТетрациклин104.0111.5104.4Хлортетрациклин95.9106.599.5Окситетрациклин106.4107.4100.6Доксициклин111.2110.9100.3Таблица 66Прецизионность RSD rНаименованиеантибиотикатетрациклиновойгруппыТетрациклинХлортетрациклинОкситетрациклинДоксициклинRSDr, повторяемость, %1 уровень2 уровень3 уровеньДень 1День 2День 3День 1День 2День 3День 1День 2День 313911427321151314104123356786684435271047343Таблица 67Прецизионность RSDwRНаименование антибиотикатетрациклиновой группыТетрациклинХлортетрациклинОкситетрациклинДоксициклинRSDwR, внутрилабораторнаявоспроизводимость, %1 уровень2 уровень3 уровень11138569873464119Таблица 68Прецизионность CCα , CCβНаименование антибиотикаCCα, mkg/kgCCβ, mkg/kg1112111112131312ТетрациклинХлортетрациклинОкситетрациклинДоксициклинЗаключениеВ результате проведенной валидации установлено, что прикоэффициентиспользовании данного методакорреляции линейнойрегрессии для всех антибиотиков тетрациклиновой группы составил больше0,99, пределколичественного определения (LOQ) по всем антибиотикамтетрациклиновой группы составил 1 мкг/кг, селективность, т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
