Диссертация (1150384), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Эффективные электрофоретические подвижности белков (μeff) ивоспроизводимость этих величин при введении PEI-Mal А в состав рабочегобуфера (pH 2,2).PEI-Mal A(мг/мл)RSD, %0μeff,2м /В·сRSD, %1μeff,2м /В·сRSD, %2μeff,2м /В·сRSD, %4μeff,2м /В·сАльбуминЛизоцимМиоглобинИнсулин0,70,91,71,52,76 × 10-42,70 × 10-42,61 × 10-42,28× 10-42,02,23,00,82,64 × 10-42,57 × 10-42,48 × 10-42,09 × 10-41,92,12,15,42,58 × 10-42,52 × 10-42,44 × 10-42,14 × 10-46,26,15,64,12,96 × 10-42,90 × 10-42,83 × 10-42,42 × 10-43,16 × 10-43,11 × 10-43,05 × 10-42,64 × 10-41,71,71,6-2,10× 10-42,10× 10-42,10 × 10-4< 2, 0× 10-4RSD, %8μeff,2м /В·сRSD, %10μeff,2м /В·с98Таблица 7.
Эффективные электрофоретические подвижности белков (μeff) иих воспроизводимость при введении PEI-Mal В в состав рабочего буфера (pH 2,2).PEI-Mal В(мг/мл)RSD, %0μeff,2м /В·сRSD, %0,5μeff,2м /В·сRSD, %1μeff,2м /В·сRSD, %2μeff,2м /В·сRSD, %5μeff,2м /В·сRSD, %10μeff,2м /В·сАльбуминЛизоцимМиоглобинИнсулин0,70,91,71,52,92 × 10-42,84 × 10-42,69 × 10-42,27× 10-40,40,51,80,63,56 × 10-43,48 × 10-43,32 × 10-42,87 × 10-40,50,71,21,13,63 × 10-43,56 × 10-43,4 × 10-42,95 × 10-40,30,80,60,43,52 × 10-43,46 × 10-43,33 × 10-42,90 × 10-41,31,11,01,03,59 × 10-43,54 × 10-43,45 × 10-43,01 × 10-40,70,61,1-3,63× 10-43,62× 10-43,59 × 10-43,03× 10-499Таблица 8.
Эффективные электрофоретические подвижности белков (μeff) иих воспроизводимость при введении PEI-Mal С в состав рабочего буфера (pH 2,2).PEI-Mal С(мг/мл)АльбуминЛизоцимМиоглобинИнсулин0,70,91,71,52,76 × 10-42,70 × 10-42,61 × 10-42,28× 10-44,93,33,13,23,50 × 10-43,47 × 10-43,35 × 10-43,03 × 10-42,32,11,92,23,86 × 10-43,80 × 10-43,70 × 10-43,36 × 10-41,91,41,31,83,55 × 10-43,51 × 10-43,46 × 10-42,99 × 10-42,30 × 10-42,30 × 10-42,30 × 10-42,24 × 10-41,71,71,6-2,10× 10-42,10× 10-42,10 × 10-4< 2, 0× 10-4RSD, %0μeff,2м /В·сRSD, %0,5μeff,2м /В·сRSD, %2μeff,2м /В·сRSD, %5μeff,2м /В·сRSD, %8μeff,2м /В·сRSD, %10μeff,2м /В·сНаблюдалось постепенное уменьшение скорости ЭОП с -6.4× 10-5 до -1.6×10-4 см2/В/с при повышении концентрации полимера PEI-Mal C с 0,5 до 10 мг/млиз-заувеличенияколичестваадсорбированныхположительно-заряженныхмолекул полимера на поверхности кварцевого капилляра.Введение полимеров структур А и В (бóльшая степень функционализациимальтозой) в рабочий буфер приводило к увеличению времен миграции и100снижению эффективности; селективность разделения при этом практически неменялась (Рисунок 55).а)б)в)Рис.
55. Зависимость (а) времен миграции, (б) эффективности (N) и(в) селективности разделения (α) от концентрации полимера PEI-MalA25 вфосфатном буферном растворе (рН 2,2); М – миоглобин, И – инсулин, А –альбумин.Введение 0,5-2 мг/мл полимера структуры С (PEI-Mal C) приводит лишь кнезначительному увеличению эффективности, однако уже при концентрацияхполимера выше 10 мг/мл скорость ЭОП возрастает, а селективность разделенияснижается. При этом параметры миграции заметно растут (до 10 мин) и резкоувеличивается эффективность (до 400 000 т.т./м) (Рисунок 56). Этот полимер101характеризуетсянаименьшейстепеньюфункционализациимальтознымигруппами, и положительно заряженное ядро полимера более доступно.
Важноотметить, что при концентрации более 5 мг/мл появляется отрицательный ЭОП:заряженные молекулы полимеров модифицируют поверхность капилляра сучастием водородных связей.Обнаруженинтересныйфакт.ЭОПдвижетсявпротивоположномнаправлении по отношению к аналитам. В результате эффективная скоростьмиграции белков уменьшается, и наблюдается эффект концентрирования, чтоважнокакприопределениисуммарногосодержаниябелка,такииндивидуального аналита (Рисунок 56).а)б)Рис.
56. Зависимость (а) времен миграции и (б) эффективности (N) приэлектрофоретическом разделении белков (ЭКХ) от концентрации полимера PEIMal С25 в фосфатном буферном растворе (рН 2,2).Таким образом, обнаружено, что дендритный полимер выполняет двойнуюфункцию: он выступает в качестве псевдостационарной фазы и модификатораповерхностипрепятствуеткварцевогоадсорбциикапиллярабелков(Рисунокна57).Это,стенкахвсвоюкапилляра,очередь,увеличиваявоспроизводимость параметров миграции при рН=10,2, а при рН=8,5 – приводит102к сильной адсорбции белков на модифицированных стенках капилляра за счетэлектростатических взаимодействий.а)б)AU0.016AU20.01420.0140.01240.012HSA0.010Поглощение40.0100.00830.0060.00410.0020.00830.0060.0040.0020.000nm00.000 nm015010015020025030035040045050055050100150200250300350400450secsecРис.
57. Электрофореграмма модельной смеси белков (лизоцим,миоглобин, инсулин, альбумин). Ввод пробы: 5с×30мбар; 15кВ; λ=214 нм.Рабочий электролит: 75 мМ боратный буфер (рН 10,2).1 – лизоцим, 2 –миоглобин, 3 – инсулин, 4 – альбумин.а) Без добавки полимера PEI-MalA25;б) С добавкой полимера PEI-MalA25 в боратный буферПолученные результаты позволяют утверждать, что полимеры PEI-Mal,введенные в состав рабочего электролита при низких концентрациях (0,5 мг/мл),могут быть использованы в качестве динамического покрытия для подавлениянеобратимой адсорбции белка при рН < 7. Применение высоких концентрацийPEI-Mal приводит к ко-миграции белков. Чтобы улучшить стабильность покрытияи избежать высоких концентраций полимеров в растворе, нами была предпринятапопытка ковалентного связывания макромолекул дендритного полимера квнутренней поверхности кварцевого капилляра.103ГЛАВА 5.
РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ НА PLOT-ДЕНДРИТНЫХ КОЛОНКАХМЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ЭЛЕКТРОХРОМАТОГРАФИИАльтернативой динамическому покрытию явилось создание тонкого слояполимера на внутренней поверхности кварцевого капилляра. С этой целью былисинтезированы PLOT-дендритные, монолитные и PLOT-метакрилатные колонки иизученовлияниесоставаиконцентрациибуферногоэлектролитанаэлектрофоретическое разделение белков с контролем скорости ЭОП в условияхкапиллярнойэлектрохроматографии(КЭХ)икапиллярногозонногоэлектрофореза (КЗЭ).Получение колонок с ковалентным покрытием, мальтозилированнымсверхразветвленнымполиэтиленимином,включалотравлениекварцевогокапилляра, силанизацию (Рисунок 58) и последующую функционализацию дляобеспечения ЭОПа.Значение первых двух этапов синтеза колонки аналогично получениюмонолитных и PLOT-метакрилатных колонок.OOSi OH+SiOOSiOSiOOOOРис.
58. Схема взаимодействия силанольных групп с силанизарующимагентом (3-глицидоксипропил)триэтоксисиланом.Далее силанизированный капилляр заполняли дегазированным растворомдендритного полимера (Рисунок 59).104PEINH2PEIOSiSiOPEIOOРис. 59. Схема получения PEI-Mal покрытия.На Рисунках 60 и 61 приведены соответствующие электрохроматограммы вусловиях КЭХ и МЭКХ маркера электроосмотического потока – ДМСО.1AU0.0550.0500.0450.0400.0350.0300.0250.0200.0150.0100.0050.000nm010020030040050060070080090010001100secРис. 60. Электрохроматограмма ДМСО (3% от объема рабочего буфера);кварцевый капилляр 45см×50 мкм; 100 мМ фосфатный буфер (pH=2,2);напряжение -20 кВ, детектирование при 214 нм.105AU0.0250.0200.0150.0100.0050.000nm050100150200250300350400450500550secРис.
61. Электрофореграмма ДМСО (3% от объема рабочего буфера)45см×50 мкм кварцевый капилляр; 100мМ фосфатный буфер (pH=2,2);Напряжение +20 кВ, детектирование при 214 нм (на примере PEI-MalB(25)).Лучшее разделение белков наблюдалось в кислой среде (рН 2,2);электрофоретическое разделение белков проводилось при положительнойполярности.
Нами обнаружен эффект концентрирования в условиях стэкинга сбольшим объемом вводимого образца без переключения полярности, (известногов англоязычной литературе как LVSS - Large Volume Sample Stacking): привведении большого количества пробы ЭОП выталкивал раствор матрицы пробыиз капилляра, что и приводило к концентрированию аналитов.Подобная ситуация независимо подтверждала обнаруженную нами ранеемодификацию стенок кварцевого капилляра дендритным полимером структуры Св условиях МЭКХ при pH=2,2.106На Рисунках 62 и 63 приведены электрохроматограммы смеси четырехтестовых белков в условиях КЭХ на колонках PLOT-PEI-25k-Mal-A и PLOT-PEI25k-Mal-C.
Характеристика колонок дана в таблице 9.Рис. 62. Электрофореграмма смеси стандартов белков (1 мг/мл) на PLOTколонкеPEI-25k-Mal-A. Буферный электролит: 100 мМ фосфатный буфер (рН=2,2).Гидродинамический ввод пробы 5с×30мбар. Рабочее напряжение 20кВ. УФдетектирование (214 нм).1 – альбумин, 2 – миоглобин, 3 – лизоцим, 4 – инсулин.Рис.
63. Электрофореграмма смеси стандартов белков (1 мг/мл) на PLOT-PEIколонке 25k-Mal-C. Буферный электролит: 100 мМ фосфатный буфер (рН=2,2).Гидродинамический ввод пробы 5с×30мбар. Рабочее напряжение 20кВ. УФдетектирование (214 нм).1 – альбумин, 2 – миоглобин, 3 – лизоцим.107Таблица 9. Сравнительные аналитические характеристики подготовленныхPLOT-дендритных колонокПолимер АПолимер ВПолимер Сµ(ЭОП), мин7,5310,6612,93Эффективность (N), т.т./м662007000058000Селективность (α) для пары Mio-Alb1,041,051,06Лучшиерезультатыпоэффективностиполучены,наколонке,модифицированной сверхразветвленным полиэтиленимином структуры В, анаиболее сильный ЭОП наблюдался при проведении КЭХ на колонке,модифицированной полимером А (таблица 9). При этом стоит отметить, что прихранении колонок скорость электроосмотического потока уменьшалась внаибольшейстепенидляполимераструктурыА(максимальнофункционализированный мальтозой сверхразветвленный полиэтиленимин), чтообъясняется частичным гидролизом мальтозных фрагментов в водном растворе.Большая селективность разделения для трудно разделяемой пары белковальбумин-миоглобин получена на колонке с полимером С.
При этом следуетотметить, что инсулин (белок с наименьшей молекулярной массой) не достигалокна детектирования, вероятно за счет образования наиболее прочного комплексаего с полимером С.Подобная картина наблюдалась и при динамическом покрытии капилляраполимером С. В процессе работы полимерный адсорбированный слой постепенновымывался,ирегистрировалсяпредположение (Рисунок 64).пикинсулина,чтоподтверждаетнаше108а)б)в)Рис. 64. Электрофореграммы смеси стандартов белков на динамическимодифицированной PEI-25k-Mal-С колонкеа) после 1 анализа, б) после 4 анализов, в) после 5 анализов.Ввод пробы: 5с×30мбар. КЭ: 20кВ; λ=214 нм;рабочийэлектролит:100мМфосфатныйбуфер(рН2,2).1 – альбумин, 2 – миоглобин, 3 – лизоцим, 4 – инсулин.Исходя из результатов всех предыдущих экспериментов, а также принимаяво внимание меньшее время анализа, для дальнейшей работы выбран полимерструктуры А с массой ядра 25 кДа полимер с наиболее плотной мальтознойоболочкой.ДлянезависимогоповерхностиСРПэллипсометрии.подтвержденияпроведенрядотсутствияспециальныхсорбциибелковэкспериментовнаметодом109ГЛАВА 6.
ЭЛЛИПСОМЕТРИЯОставался нерешенным вопрос: не происходит ли на модифицированнойполимером поверхности капилляра сорбция белков, приводящая к потеряманалитов в процессе анализа?Для ответа на этот вопрос нами проведен ряд независимых экспериментовметодом эллипсометрии [73].Для исследования методом эллипсометрии в качестве модели внутреннейповерхностикварцевогокапилляраиспользоваласькремниеваяпластина.Поскольку кварц и биоорганические среды имеют весьма близкие значенияпоказателя преломления (а, значит, и низкий оптический контраст), выбранныммодельным объектом стала кремниевая поверхность. Поверхность кремния вреальных условиях всегда покрыта оксидной пленкой (2-3 нм) и можетрассматриваться в первом приближении, как аналог кварцевой поверхности.Кремний же в качестве подложки дает хороший контраст с биоорганическимипокрытиями и позволяет измерять толщину последних до размеров в несколькихнм.Для измерения адсорбции белков на поверхности сверхразветвленногополиэтиленимина, модифицированного мальтозой, проводили процедуру синтезапленки полимера на поверхности кремниевой пластинки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
