Диссертация (1150384), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Для этого послетравления на поверхность пластинки с помощью спин-коатера наносилась смесь,содержащуюполимерсмаксимальнымсодержаниемолигосахаридныхфрагментов (структура А. Рисунок 48) и лимонную кислоту, в качествесшивающего агента (Рисунок 65). В результате по данным эллипсометрическогоанализа формировался слой полимера толщиной ~ 20 нм.110Рис. 65. Структура полимерной пленки на поверхности кварцевойпластины. PEI – сверхразветвленный полиэтиленимин, Mal – мальтозныефрагменты.Возможность адсорбции белков (альбумин, инсулин, миоглобин и лизоцим)на поверхности (PEI-Mal A25) полимерной пленки изучалась при различныхзначениях pH рабочего буфера (2,2 и 8,5).Для этого кремниевая пластинка со слоем полимера помещалась вбуферные растворы - фосфатный (pH 2,2) или боратный (pH 8,5), и in situэллипсометр регистрировал изменение толщины пленки в течение 10 ч (Рисунок66 А, 66 Б); (таблица 10, 11) до достижения постоянного значения.111б)а)Рис.
66. Типичное набухание in situ полимерной пленки в а) фосфатномбуферном растворе (pH=2,2); б) в боратном буферном растворе (pH=8,5) при25°C.Таблица 10. Значение толщины (dэфф) и показателя преломления (n) сухогои набухшего полимерного слоя в фосфатном буфере (pH=2,2)Толщина полимерной пленки*, 0,1M фосфатный буферный раствор,pH=2,2Посленабухания(высушеннаяпластина), нм20,15Δd,нмd набухшего(в буферномрастворе), нмn- набухшего1Переднабуханием(высушеннаяпластина), нм20,640,4928,931,486221,5620,720,8429,441,480321,0320,850,1828,011,486№*Погрешность измерения толщины пленки составляет 0,5 нм (по паспортуприбора).112Таблица 11.
Толщина (dэфф) и показатель преломления (n) сухого инабухшего полимерного слоя в боратном буфере (pH=8,5)Толщина полимерной пленки*, 0,1M боратный буферный раствор, pH=8,5№Перед набуханием(высушеннаяпластина), нм120,64Посленабухания(высушеннаяпластина), нм19,08219,3817,951,4328,271,498320,5920,250,3430,341,493Δd,нмd набухшего (вnбуферномнабухшегорастворе), нм1,5629,171,498*Погрешность измерения толщины пленки составляет 0,5 нм (по паспортуприбора).Из таблицы 10,11 следует, что полимерный слой стабилен, т.е.
изменениетолщины слоя незначительно и составляет не более 2 нм за 10 ч. При этомизменение толщины слоя в течение одного эксперимента (2 ч) находится впределах погрешности (0,5 нм).Это позволило измерять адсорбцию белков после 30-минутного процессанабухания и получать результаты в пределах погрешности эксперимента. В ходеэксперимента в кювету объемом 3 мл, содержащую исследуемую пластину с уженабухшим полимером и буферный электролит (2970 мкл), добавлялся растворабелка (30 мкл) с концентрацией 10 мг/мл (Сбелка=0,1 мг/мл в кювете).Адсорбциябелканаполимернойпленкеinsituисследоваласьэллипсометрически в течение 30 мин. Затем, раствор, содержащий белок,удалялся из кюветы пипеткой.
К пластине с набухшим полимером иадсорбированным белком в той же кювете добавляли чистый буферный раствордля выявления возможной десорбции белка in situ методом эллипсометрии.Примеррезультатовэкспериментаповыявлениюадсорбции/десорбции белка представлен на Рисунке 67.возможной113А)Рис.67.БРезультатэкспериментаВ))повыявлениювозможнойадсорбции/десорбции белка методом эллипсометрии. А – первый этап: набуханиеполимерной пленки; Б – второй этап: процесс адсорбции белка; В – третий этап:процесс десорбции белка.В экспериментах с использованием фосфатного буферного электролита (pH2,2) молекулы белка и полимера находятся в катионной форме (Рисунок 68) засчетпротонированияаминогрупп.
Это приводит к электростатическомуотталкиванию между ними.Рис. 68. Адсорбция белков на поверхности полимерной пленки при pH=2,2.114Из таблицы 12 видно, что количество адсорбированного белка непревышает 1 мг/м2, что соответствует < 0,1% от общего содержания белка врастворе. Таким образом, в этих условиях количественных потерь белков при ихэлектрохроматографическом определении практически не происходит.Таблица 12. Исследование адсорбции белков на поверхности полимернойпленки при pH буферного раствора 2,2 и 8,5.pH 2,2БелокАльбумин№dэфф, нм12,802mdэфф, нм0,712,070,53,100,722,250,533,100,733,020,741,900,542,330,652,100,552,540,662,000,571,900,5[мг/м²][мг/м²]-22,1%13,4%11,900,5117,904,321,600,4212,102,931,500,4313,903,341,700,4416,403,951,600,461,800,471,200,3СКО, %Инсулинm№СКО, %ЛизоцимpH 8,5-13,49%14,95%12,000,511,000,321,800,421,500,411531,600,441,500,4СКО, %Миоглобиндругом2,000,5-10,80%26,15%15,001,211,000,224,001,020,400,133,600,930,900,2СКО, %В314,19%случае(pH=8,5)34,23%толькоодинбелок(лизоцим)имеетпротивоположный полимеру заряд.
Полимер, альбумин, миоглобин и инсулинзаряжены отрицательно, а лизоцим – положительно (Рисунок 69).Рис. 69. Адсорбция белков на поверхности полимерной пленки при pH=8,5.В данном варианте толщина слоя адсорбированного лизоцима оказаласьравной ~ 18 нм (это соответствует 4 мг/м2, или 0,4%, от общего содержания белкав растворе). Процесс адсорбции протекает достаточно быстро (<1 мин), послечего толщина пленки практически не меняется.
Наблюдаемая адсорбциянеобратима: десорбция белков с поверхности полимера при замене раствора белкана чистый буферный электролит не наблюдалась.На Рисунках 70 и 71 приведены графические зависимости толщиныбелкового слоя на поверхности полимера после адсорбции, а также первичной и116вторичной замены буферного электролита (измерение десорбции), содержащегобелок на чистый буферный электролит при pH 2,2 и 8,5 соответственно.Рис. 70.
Изменение толщины белкового слоя на поверхности полимера приpH=2,2.□–инсулин,◊–миоглобин,×–альбумин,Δ–лизоцим.Этапы: 0 – набухший слой полимера, 1 – адсорбция белков, 2 – десорбция, 3– повторная десорбция.Рис. 71. Изменение толщины белкового слоя на поверхности полимера приpH 8,5. □ – лизоцим, ◊ – альбумин, × – инсулин, Δ – миоглобин.Этапы: 0 – набухший слой полимера, 1 – адсорбция белков, 2 – десорбция, 3– повторная десорбция.117На основании полученных результатов можно заключить, что полимерныйслойнавнутреннейповерхностикварцевогокапиллярадействительнопрепятствует адсорбции белков и является перспективной стационарной фазой вусловиях капиллярной электрохроматографии.118ГЛАВА 7. ON-LINE КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ БЕЛКОВ В УСЛОВИЯХКАПИЛЛЯРНОЙ ЭЛЕКТРОХРОМАТОГРАФИИ НА PLOT-PEI-MALКОЛОНКАХДругая проблема при электрофоретическом разделении белков – высокиепределы обнаружения аналитов, затрудняющие использование КЭХ в практикеклинической медицины.
Решением таких проблем мог быть поиск новыхвариантов on-line концентрирования, включая комбинирование различныхмеханизмов,позволяющихполучатьсопоставимыес высокоэффективнойжидкостной хроматографией (ВЭЖХ) отношения сигнал/шум. Традиционно дляконцентрирования аналитов в КЭ используют стэкинг, свипинг и динамическийpH скачок.
В данной работе уделено особое внимание таким вариантам on-lineконцентрирования как стэкингу с большим объемом образца (LVSS), LVSS с«водной пробкой» и электростэкингу.Как уже отмечалось, лучшее разделение белков наблюдалось при рНрабочего буфера 2,2. В этих условиях поверхность капилляра, покрытогосверхразветвленным полиэтиленимином, заряжена положительно, что, в своюочередь, генерирует отрицательный электроосмотический поток. При этом белкиэлектрофоретически мигрируют к катоду, поскольку аналиты имеют большойположительный заряд.В КЭ различают два способа ввода пробы: гидродинамический, электрокинетический.Ввод пробы давлением (гидродинамический) обеспечивается созданиемразницы давлений между сосудом для пробы и выходным концом капилляра, приэтом давление либо повышается в сосуде для пробы, либо снижается на концекапилляра. Объем вводимой пробы зависит только от разницы давлений ивремени ввода пробы; при временах 3-7 с разность значений давлений лежит вобласти нескольких миллибар (1000 мбар).
Не зная строгого объема введенной119пробы, мы, тем не менее, всегда уверены в точности дозирования, поскольку всесистемы КЭ оперируют величиной произведения давления на время ввода.Гидродинамический способ ввода не нарушает состав пробы. Это позволяетпроводить дозирование из одной пробирки несколько раз.Электрокинетический ввод пробы. При данном способе ввод пробыосуществляется путем подачи высокого напряжения на электроды, когда на входеустановлена пробирка с раствором пробы, а на выходе — с рабочим буфером. Засчет возникающего при этом ЭОП компоненты пробы поступают в капилляр.Количество введенной пробы зависит от величины приложенного напряжения,времени, в течение которого оно приложено, и подвижности компонентов пробы.Особенностью такого ввода пробы является и то, что компоненты с большейподвижностьюбудутконцентрироватьсяэффективнеепосравнениюсмалоподвижными ионами, которые в случае недостаточного времени ввода,вообще могут не попасть в капилляр.Таким образом, по сравнению с гидродинамическим вариантом мы имеем вбольшей или меньшей степени дифференциацию состава пробы в капилляре и висходном растворе.
Это означает, что электрокинетический способ ввода пробыподразумевает только однократный ввод образца из одной пробирки. Этотвариант является наименее воспроизводимым [76].Дляанализабелков,содержащихсявнизкихконцентрацияхвбиологических жидкостях, нами испытано и реализовано несколько вариантов online концентрирования белков с использованием стэкинга с большим объемомвводимого образца (LVSS) и его комбинацию с электростэкингом (FESI-LVSS),т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
