Диссертация (1150384), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Зависимость селективности разделения при определении белковв ЭКХ от концентрации полимераа) PEI-Mal A25; б) PEI-Mal A5 в боратном буферном электролите (рН 8,5);М – миоглобин, И – инсулин, А – альбумин.89Следует отметить важность такого фактора как значение рН буферногоэлектролита.Выбранныеаналитыидендритныеполимерыявляютсяионогенными соединениями. При изменении величины рН меняется иханалитическая форма, что может сказаться на скорости и направленииэлектроосмотического потока, временах миграции аналитов, эффективности иселективности разделения.В первоначальной серии электрофоретических экспериментов изученовлияние сверхразветвленного полиэтиленимина в качестве псевдостационарнойфазы (ПСФ) на параметры миграции белков – альбумина, лизоцима, миоглобина,инсулина – при различных значениях рН рабочего буфера: 2,2; 8,5; 10,2.Отметим, что•при pH 2,2: молекулы белков и полимеров находятся в катионной форме;•при pH 8,5: молекулы белков – в анионной форме, а полимеров – вкатионной;•при pH 10,2: молекулы белков и полимеров находятся в анионной форме.Значения рН рабочего буфера выбирались в соответствии со значениямиизоэлектрических точек (pI) определяемых белков (таблица 1) и полимера.Структура А содержит наибольшее количество мальтозных концевых групп,обладает плотной мальтозной оболочкой и, как следствие, низким значениемизоэлектрической точки (pI=8,1).
Структуры В и С содержат значительноменьшее количество мальтозных остатков (40 и 20%, соответственно), в меньшейстепени экранируют положительно заряженное ядро и характеризуются болеевысокими значениями pI (9.1 и 9.4, соответственно). Таким образом, правильныйвыбор замещенного гликозилированного полимера и фонового электролитапозволяетрегулироватьселективностьразделениямаркерныхбелковвкапиллярном электрофорезе (КЭ).Зависимость скорости электроосмотического потока от концентрацииполимера в рабочем буферном растворе и его типа представлена на Рисунок 53.90Рис. 53. Подвижность электроосмотического потока (по сравнению сДМСО) в присутствии (А) PEI-Mal A, (Б) PEI-Mal B и (В) PEI-Mal C в составебуферного раствора.Условия электрофоретического анализа: +20 кВ (pH 10,2) или –20 кВ (pH2,2 и 8,5); капилляр: 45.5 см х 50 мкм (внутренний диаметр) Lэфф 38 см; рабочийэлектролит: 100 мМ фосфатный буферный раствор (pH 2,2); 50 мМ боратныйбуферный раствор (pH 8,5); 100 мМ боратный буферный раствор (pH 10,2); 214нм.При всех выбранных значениях pH увеличение концентрации полимера всоставе рабочего электролита приводило к снижению скорости ЭОП.При pH 10,2 полимеры структуры А и В (PEI-Mal A и PEI-Mal B)выполняютрольпсевдостационарнойфазы,вседендритныеполимеры,независимо от степени функционализации мальтозой, заряжены отрицательно91(Рисунок 48), и поэтому не взаимодействуют с отрицательно заряженнойповерхностью кварцевого капилляра и не вносят изменений в направление искорость электроосмотического потока.Полимер с меньшей функционализацией мальтозой PEI-Mal C приувеличении концентрации образует межмолекулярные агрегаты, что приводит кзакупориваниюкварцевогокапилляра,иработаснимстановитсянецелесообразной.Изучено влияние концентрации сверхразветвленных полиэтилениминов наразделение четырех белков: миоглобин (pI 7.0), инсулин (pI 5.5), лизоцим (pI 11.0)и альбумин (pI 4.7) в условиях ЭКХ.
При pH 10,2 все белки (кроме лизоцима)находятся в анионной форме, что снижает и препятствует адсорбции белков наотрицательно заряженной поверхности кварцевого капилляра.В этих условиях лизоцим заряжен положительно и не детектируется.Введение полимеров структур А и В в рабочий буфер привело лишь кнезначительному изменению электрофоретических подвижностей аналитов.(таблица 3).Таблица 3. Эффективные электрофоретические подвижности белков (μeff) ивоспроизводимость при введении полимера PEI-Mal B в состав рабочего буфера(pH 10,2).Концентрация PEI-МиоглобинИнсулинАльбуминRSD, %2,12,00,8μeff, м2/В·с1,90 × 10-41,99 × 10-42,45× 10-4RSD, %0,70,40,2μeff, м2/В·с1,89 × 10-41.99 × 10-42,47 × 10-4RSD, %1,93,01.7μeff, м2/В·с1,53 × 10-41,71 × 10-42,19 × 10-4Mal B, мг/мл00,5192248RSD, %0,70,40,3μeff, м2/В·с1,81 × 10-42,08 × 10-42,56 × 10-4RSD, %0,41,10,4μeff, м2/В·с1,68 × 10-42,07 × 10-42,5 × 10-4RSD, %2,32,51,8μeff, м2/В·с1,72 × 10-41,48 × 10-42,36 × 10-4Однако при бóльших концентрациях полимера структуры В (≥ 4 мг/мл)наблюдалось значительное увеличение параметров миграции (особенно дляинсулина и альбумина).Учитывая постоянное значение тока в капилляре во время анализов(таблица 4) как показателя изменения ионной силы рабочего электролита, можнозаключить, что увеличение времен миграции аналитов свидетельствует овзаимодействии полимера PEI-Mal B с макромолекулами инсулина и альбумина иобразовании соответствующих агрегатов.Таблица 4.
Значения тока внутри капилляра во время анализа при введенииPEI-Mal в состав рабочего буфера (pH 10,2)КонцентрацияPEI-Mal A,мг/мл00,5155,0Образе КонцентрацияPEI-Mal B25,цмг/млДМСО0Белки*54,5ДМСО55,0Белки54,5Белки58,0ДМСО56,5БелкиТок, мА55,0-56,00,51Ток, мАОбразец53,0-54,0ДМСО54,0Белки52,0ДМСО53,0Белки53,0Белки54,0Белки54,0ДМСО54,0Белки9324857,0Белки55,0Белки55,0ДМСО54,5ДМСО54,0Белки55,5Белки54,0Белки55,5Белки56,0ДМСО54,5ДМСО55,5Белки55,0Белки56,0Белки55,5Белки57,0ДМСО54,5ДМСО57,0Белки55,5Белки248*Белки – водный раствор стандартов белков (миоглобин, инсулин, альбумин), 1 мг/мл.Выявленные различия во взаимодействии PEI-Mal А и PEI-Mal B с белкамимогут быть обусловлены разницей в гидрофильности макромолекул полимеров,их способностью образовывать комплексы с боратными ионами, находящимися вбуферном растворе, распределением заряда на поверхности и др.Рассмотрим другую ситуацию: значение рН рабочего буфера 8,5.При pH 8,5 наличие полимеров структуры PEI-Mal A (максимально плотнаяолигосахариднаяоболочка)вбуферномрастворепривелолишькнезначительному снижению скорости ЭОП, что по-прежнему явилось следствиемнезначительной сорбции отрицательно заряженного PEI-Mal A на внутреннейповерхности капилляра.При этом добавка PEI-Mal B в буферный раствор значительно измениласкорость электроосмотического потока.
При pH=8,5 молекулы полимера PEI-MalB, в отличие от молекул PEI-Mal А, все еще положительно заряжены и могутдостаточно эффективно сорбироваться на отрицательно заряженной внутреннейповерхности кварцевого капилляра.Итак, при pH рабочего буфера 8,5 стенки кварцевого капилляра заряженыотрицательно; молекулы полимеров (структуры В и С) – положительно; молекулыбелка лизоцима также заряжены положительно (рI=11,0) и, в отличие от другихбелков, сильно сорбируются стенками кварцевого капилляра.
Поэтому в94последующих экспериментах влияние сверхразветвленных полимеров изучалосьна модельной смеси трех белков: миоглобина, альбумина и инсулина.Нами зафиксирован факт динамической модификации отрицательнозаряженнойповерхностиОтрицательнокварцевогозаряженныебелкикапиллярамолекуламиэлектростатическиполимеров.взаимодействуютсположительно заряженным дендритным полимером на поверхности капилляра исорбируются, что приводит к значительному увеличению времен миграциибелков и увеличению селективности разделения (см. приложение 2).Влияние плотности мальтозной оболочки и, соответственно, значенийизоэлектрических точек полимеров PEI-Mal A и PEI-Mal B (Рисунок 48) при8,5pHможетбытьпроиллюстрированосравнениемсоответствующихэлектрофореграмм (Рисунок 54).A30B8 mg/mL8 mg/mL30252 mg/mL252 mg/mL201 mg/mLmAUmAU20151 mg/mL150.5 mg/mL100.5 mg/mL10550 mg/mL00 mg/mL001234567Migration time (min)0510152025303540Migration time (min)Рис.
54. Разделение белков в условиях МЭКХ при различных концентрацияхдобавок полимеров(А) PEI-Mal А25 и (Б) PEI-Mal В25 в составе буферного электролита (50 мМборатный буфер, рН 8,5) УФ: 214 нм.Порядок миграции аналитов: миоглобин, инсулин, альбумин.95Полимер PEI-Mal A (0,5-2 мг/мл) выполнял в рабочем буферномэлектролите роль псевдостационарной фазы (Рисунок 54A). Лишь при высокихконцентрациях (8 мг/мл) присутствие модифицированного полиэтиленимина PEIMal A вызывало увеличение времен миграции аналитов (Рисунок 54 A: верхняяэлектрофореграмма). Обнаружено, что небольшие концентрации положительнозаряженного полимера В (с меньшим содержанием мальтозных фрагментов, чем вслучае полимера структуры А) в составе буфера приводили к заметному ростувремен миграции белков (Рисунок 54 B).При этом альбумин не регистрируется уже при добавлении 0,5 мг/млполимера как при положительной, так и при отрицательной полярности: скореевсего это вызвано образованием довольно прочного его комплекса с полимеромструктуры В на стенках капилляра.С использованием дендритного полимера PEI-MalC25, содержащегонаименьшее число мальтозных фрагментов, в качестве псевдостационарной фазы– ни один белок на электрофореграмме не был зарегистрирован.Объяснение этому следующее: наименьшее экранирование положительнозаряженного полиэтилениминового ядра в случае полимера С приводит кусилению электростатических взаимодействий с отрицательно заряженнойповерхностью кварцевого капилляра; ЭОП подавлен; взаимодействия полимера сотрицательно заряженными молекулами аналитов возрастают.Кроме того, важно отметить, что после проведения электрофоретическихэкспериментов с введением полимера С в рабочий буфер, требуется значительноболее длительная промывка, чем для других полимеров, кварцевого капилляра.В кислой среде (pH=2,2) диссоциация силанольных гидроксильных группкапилляра подавлена; ЭОП отсутствует; значение pH рабочего буфера нижеизоэлектрической точки полимеров); доступные аминогруппы полимеров В и Спротонируются.
В результате, при введении этих полимеров в состав буферанаблюдается обращение ЭОП, поскольку они адсорбируются на поверхностикапилляра с формированием катионного динамического покрытия, что вызываетгенерацию анодного электроосмотического потока.96Намипроведенаоценкаполученногодинамическогопокрытия:воспроизводимость по величине ЭОП от анализа к анализу составила 1,4-3,3%(n=50); день/день 3,6-4,4 % (n=50) (таблица 5).Высокая стабильность покрытия обеспечила и воспроизводимость временмиграции аналитов (от анализа к анализу 1,6-1,8% (n=5); день/день 2,0-3,1 %(n=5)).Таблица 5.Воспроизводимость скорости ЭОП и RSD белков наколонках, модифицированных полимерами PEI-Mal (динамическое покрытие иковалентно связанное) (pH 2,2)RSD времен миграции (%, n=50)Структураполимераот анализа к анализу / день-деньДМСОАльбуминИнсулинМиоглобинЛизоцим1,6 / 2,71,7 / 3,12,5 / 3,63,0 / 2,8Динамическое покрытиеPEI-Mal A2,0 / 4,3PEI-Mal B1,4 / 3,8PEI-Mal C3,3 / 4,01,8 / 2,51,7 / 2,0Ковалентное покрытиеPEI-Mal A1,8 / 5,8PEI-Mal B1,0 / 4,4PEI-Mal C3,5 / 3,62,0 / 3,02,1 / 3,8Обнаружено, что при концентрациях полимера 0-5 мг/мл с уменьшениемплотности мальтозной оболочки дендритного полимера происходит увеличениеэффективных электрофоретических подвижностей (μeff) аналитов (таблицы 6-8).Это свидетельствует о более сильных взаимодействиях между полимером сменьшим числом мальтозных фрагментов и молекулами белков.97Таблица 6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
