Диссертация (1150384), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Можно использовать итрадиционный вариант (положительная полярность), но это требует подавленияили обращения ЭОП, что достигается введением специальных добавок(диметилентриамин, тетрадецилтриметиламмоний бромид) в состав рабочегобуфера или снижением его рН в случае быстро мигрирующих анионов [78].Обязательное условие стэкинга с усилением поля заключается в том, чтоионная сила раствора образца должна быть значительно ниже, чем рабочегоэлектролита.52БуферныйэлектролитАБуферныйэлектролитРаствор пробы++++-+++++Б+++++++++Область низкой проводимости,Высокое электрическое поле-Область высокойпроводимостиЕСила электрического поляРис.
32. Схема стэкинга образца с усилением поля в КЭ [77].(А) Ввод пробы, растворенной в низкопроводящей матрице (разбавленномбуфере или воде). При включении напряжения возникает высокое электрическоеполе в зоне пробы относительно остальной части капилляра, катионы быстромигрируют в этой области до границы низкого поля в зоне разделительногобуфера;(Б) катионы замедляются и концентрируются на границе между зонойпробы и буферным электролитом.С применением стэкинга с усилением поля достигается не менее, чем 10кратное(длягидродинамическоговвода)иболее,чем1000-кратноеконцентрирование аналита (для электрокинетического ввода).Эффективность концентрирования пропорциональна степени усиления поля( γ ): чем больше разница концентраций между буферным электролитом ираствором пробы, тем уже зона сконцентрированной пробы (22):531LstackLinjγ(22)где Linj – первоначальная длина зоны пробы,Lstack – длина зоны пробы после стэкинга,– отношение силы электрических полей в растворе пробы (S) и буферномэлектролите (BGS) (уравнение (23)):(23)Однако внутри капилляра из-за локальных изменений скорости ЭОПвозникает ламинарный поток, снижающий эффективность концентрирования засчет размывания сконцентрированных зон (дестэкинг).Поэтомуобычновкачестве растворителя пробы используется рабочий буфер, разбавленный ~ в 10раз [79].Стэкинг с усилением поля с водной пробкой (HC-FASS – head -column fieldamplified sample stacking).Сутьэтоговариантавнутрикапиллярногоконцентрированиявследующем: непосредственно перед вводом пробы в капилляр вводится «воднаяпробка».
На входном конце кварцевого капилляра формируется зона высокогополя, что позволяет ввести заряженные аналиты с высокой скоростью. Приэлектрокинетическом вводе пробы аналиты концентрируются на границе междунизкопроводящей зоной и рабочим буфером: катионы концентрируются безпереключения полярности; для стэкинга анионов используют отрицательнуюполярность.Локальная электрофоретическая скорость аналитов намного большескорости ЭОП. По сравнению с классическим вариантом эффективность этого54способа не ограничена вводимым объемом пробы.
Подобный прием используетсяпри анализе ДНК, лекарственных препаратов в сыворотке крови. Достигаютсяфакторы концентрирования > 1000 [80, 81].Благодаря простоте реализации стэкинг с усилением поля легко сочетается сразличными буферными системами и способами детектирования.Стэкинг с большим объемом вводимого образца (LVSS – large volume samplestacking)Характерные особенности этого варианта: направление движения всеймассы раствора противоположно электрофоретическому движению ионованалитов;скоростьдвижениярабочегобуфераменьшескоростиэлектрофоретической миграции ионов аналита.При стэкинге с большим объемом образца с переключением полярностигидродинамически вводится объем образца почти до детектора, растворенный вбуфере низкой проводимости (Рисунок 33 А).
Переключение полярности накороткое время после ввода образца приводит к частичному удалению матрицыиз кварцевого капилляра возникающим ЭОП. Анионы концентрируются в концезоны пробы на границе с рабочим буфером. Когда растворитель пробы почтиполностью удален из капилляра (что фиксируется по изменению силы тока вкапилляре: достижение 85 - 99% от максимального значения), полярность сновапереключают (Рисунок 33 Б)[81].Полярность электродов в процессе стэкинга выбирают на основании знаказарядаопределяемыхкомпонентов:дляконцентрированияанионовотрицательную, для катионов – положительную и обращение направления ЭОП.–55SEFheight = 1000.µЭОПA-++-Детекторµэф- >µЭОП+_+-+---+--+-Проба_Б +85-99% от начального тока--+_-µЭОП >µэФ--В +-_Рис. 33.
Схема стэкинга с большим объемом пробы с переключениемполярности.– область буферного электролита,– раствор пробы [81].Рассматривается и другая схема стэкинга с большим объемом образца безпереключения полярности. В этом случае за счет варьирования величины и/илинаправления ЭОП проводят стэкинг без переключения полярности.Пробурастворяютвматрицеменьшейэлектропроводности,чемпроводимость буферного раствора и гидродинамически вводят большой объем накатодном конце.
Особое условие - использование буферного электролита снизким значением рН либо модификатора ЭОП для его подавления. Анализпроводятприобращеннойполярности.ПринизкихзначенияхрНэлектрофоретическая подвижность ионов превышает скорость ЭОП, и аналитымигрируют в направлении детектора, концентрируясь на границе раздела сбуферным электролитом.
В зоне пробы возникает локальный ЭОП, вытесняющийраствор пробы из капилляра в направлении катода.56Стэкинг с большим объемом образца без переключения полярностииспользуют, когда миграция ионов пробы противоположна ЭОП или превышаетего скорость [82].Модификацией описанного варианта является т.н. двойной стэкинг,позволяющий увеличить чувствительность определения аналитов в 400 раз:одновременное применение напряжения и обратного давления.ЭлектростэкингКонцентрирование пробы в процессе электрокинетического ввода пробы –электростэкинг (field amplified sample injection, FASI) – впервые осуществлено в1991 г.
Большой объем пробы, растворенной в низкопроводящей матрице, вводятв капилляр электрокинетически и количество аналита (Ni), введенное в капилляр,оценивают по уравнению (24):(24)где А – площадь сечения капилляра (πr2),Сi (мг/мл) – концентрация аналита в пробе,tinj (с) – время ввода пробы,μepi (см2/В*с) - электрофоретическая подвижность иона аналита,μЭОП (см2/В*с) – подвижность ЭОП.Eo(мА) - сила электрического поля в системе КЭ.Скорость ЭОП должна быть намного меньше электрофоретическойскорости аналитов.С использованием электростэкинга эффективно концентрируют толькокатионные или анионные аналиты, и при этом в большей степени – ионы свысокой электрофоретической подвижностью.57Основной недостаток электростэкинга - ограниченный объем вводимойпробы.
Подавление ЭОП или приложение обратного давления позволяетувеличить степень концентрирования до 800 [76].Стэкинг с изменением pH (pH-mediated stacking)Для анализа биологических жидкостей с высокой концентрацией солейпредложен вариант стэкинга (pH-mediated stacking), при котором локальноеизменение значений рН внутри капилляра приводит к формированию области снизкой проводимостью внутри зоны пробы. Подобный вариант используется дляанализа биологических жидкостей и физиологических растворов. Введениекислоты или основания приводит к рН титрованию зоны пробы внутри капилляра:образуется область с высоким электрическим полем внутри зоны пробы (Рисунок34).
Под действием этого поля ионы аналитов ускоряются и концентрируются награнице титрования [83].Рис. 34. Схема механизма стэкинга с локальным изменением pH внутрикапилляра с использованием кислоты. (А) Электрокинетический ввод пробы в капилляр;(Б) электрокинетический ввод сильной кислоты;(В) сильная кислота титрует зону пробы до нейтральной, и проводимость врастворе пробы снижается;(Г) аналиты концентрируются в узкие зоны на границе титрования и разделяютсяв условиях КЗЭ [83].58Описанные варианты можно реализовать только для ионных компонентовпробы. Степень концентрирования находится в пределах 10 < SEFвысота<1000.1.5.2. Стэкинг нейтральных соединений в мицеллярнойэлектрокинетической хроматографии (МЭКХ)Стэкинг нейтральных аналитов в МЭКХ предложен в 1994 г.
японскимхимикомТерабе.Аналитырастворяютсявмицеллярномраствореприконцентрации, большей критической концентрации мицеллообразования (ККМ),но меньшей, чем концентрация ПАВ в разделительном буфере. За счет усиленияполя в зоне пробы образующиеся заряженные комплексы «аналит-мицеллы»имеют большую электрофоретическую подвижность в зоне образца по сравнениюс зоной рабочего электролита [81].Образец растворяют в низкопроводящей матрице. На короткое время послеввода образца переключается полярность с последующим возвращением внормальный режим (reversed electrode polarity stacking mode(REPSM)). За счетинверсии полярности матрица удаляется, образующиеся комплексы мицелл саналитами концентрируются в пограничном слое между раствором пробы ибуфером.
Полярность вновь переключают, когда сила тока достигает 90% от егомаксимального значения.Позднее был предложен и другой вариант концентрирования: пробавводится из водного раствора; мицеллы из рабочего буфера проникают в зонуобразца и ускоряются в сильном поле матрицы образца.Аналитыконцентрируются мицеллами на входе капилляра. Этот вариант предпочтителендля соединений с большими значениями факторов емкости [84, 85].I.5.3. Применение методов стэкинга для анализаОписанные методы концентрирования нейтральных и ионных аналитовпозволяют значительно снизить значения пределов обнаружения.
Стэкинг59используют при анализе биологических образцов, объектов окружающей среды ипищевых продуктов. Некоторые примеры применения этих методов обсуждаютсяв [76].Таким образом, использование существующих, а также поиск новыхваринтов on-line концентрирования позволяют добиваться снижения пределовобнаружения для анализа аналитов на уровне их содержания в реальныхобъектах.60ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВИССЛЕДОВАНИЯ2. 1. ОборудованиеСистема капиллярного электрофореза «Нанофор 01» (ИАнП РАН) соспектрофотометрическим детектором (214 нм).Системы капиллярногоэлектрофореза «КАПЕЛЬ®-105/105M»Газовый хроматограф «Кристаллюкс 2000М» «Jasco»Жидкостный хроматограф Jasco.Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп; спектральный диапазондетектирования 400-850 нм.Весы аналитические;pH-термомилливольтметр (ООО «НП ЦЭЗ») с комбинированным pHэлектродом (ООО «Потенциал»).Система обрезания капилляров Supelco 21386-U.Пластиковые планшеты на 96 проб («Медполимер»).61Автоматические дозаторы «BIOHIT» (5-50 мкл, 50-200 мкл, 200-1000 мкл).Пробирки для микропроб Эппендорфа полипропиленовые (1,5 см3).Шприц медицинский одноразовый вместимостью 5 см3 с насадкой дляподсоединения капилляров.Капилляры кварцевые с внешним полиимидным покрытием (внешнийдиаметр – 360 мкм, внутренний – 50 мкм).Кремниевые пластины (Institut für Halbleiter- und Mikrosystemtechnik TUDresden (Germany).Спин-коутер („SPIN150-TT”, POLOS™).Эллипсометр („alpha-SE® Ellipsometer“, J.
A. Woollam Co., Inc. ).Рефрактометр( DSR-L, Schmidt + Haensch).Магнитная мешалка с нагревательным элементом („RCT basic IKAMAG®safety control“).Вакуумная печь („Heraeus VT6025 Vacutherm Oven“).Нейлоновый фильтр с диаметром пор 0,2мкм.Обработка результатов проводилась с помощью программного обеспечения«Мультихром для Windows, версия 1.5» (ООО «Амперсенд», г.Москва).2.2.
РеактивыГидроксид натрия (ч.д.а.) («Химреактив»); ацетонитрил (х.ч.) («Реахим»);солянаякислота(х.ч.)диметилсульфоксид(«Реахим»);(ч.д.а.)(«Sigma»);диметилформамид(ч.)(«Реахим»);(триметоксисилил)пропиловыйэфирметакриловой кислоты (MTS)(«Aldrich»); 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил (DPPH)(«Sigma»); ацетон («Реахим»); метанол («Реахим»); пропанол-1(ч.д.а) («Реахим»);циклогексанол(х.ч.)(«Merck»);глицидилметакрилат(GMA)(«Merck»);62метилметакрилат(MA)(«Merck»);этиленгликольдиметакрилат(EGDMA)(«Merck»); азо-бис-изобутиронитрил (AIBN) («Merck»); N-бутилэтиламин (х.ч.)(«Merck»); уксусная кислота (х.ч.) («Реахим»); диметилформамид («Реахим»);лизоцим (куриный) (х.ч.) («Sigma-Aldrich»); миоглобин (человеческих скелетныхмышц)(95-100%)альбумин(«Sigma-Aldrich»);(человека)(96-99%)инсулин(свиной)(«Sigma-Aldrich»);(«Sigma-Aldrich»);сверхразветвленныйполиэтиленимин PEI-25K (Mw 25000 г/мол, Mn 9600 Da г/мол, марка„LupasolWF”) был предоставлен компанией BASF.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
