Диссертация (1150384), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Параметр В характеризует продольнуюдиффузию. Его вклад становится существенным лишь при низких скоростяхпотока. В условиях КЭХ он очень мал.Значениетретьегопараметра(С),ответственногозамежфазныймассообмен, также меньше в КЭХ по сравнению с режимом ВЭЖХ. В колонках,заполненных пористым сорбентом с заряженной поверхностью и достаточноширокими порами (> 300 Ǻ), под действием напряжения значительный вкладвноситвнутричастичныйконвективныймассоперенос,чтоснижаетсопротивление массопереносу, и, следовательно, вклад параметра С такжеуменьшается (Рисунок 3).15а)б)Рис.
3. Массоперенос с гидродинамическим (а) и электроосмотическим (б)потоками.В ВЭЖХ перенос веществ происходит только за счет диффузии, тогда как вКЭХ массоперенос увеличивается и за счет конвекции [4]. Уменьшениепараметров А и С в уравнении Ван-Деемтера в 2-4 раза приводит к снижениювысоты, эквивалентной теоретической тарелке (H), что объясняет высокуюэффективности в КЭХ по сравнению с -ВЭЖХ.Графическая зависимость высоты эквивалентной теоретической тарелке(ВЭТТ) от линейной скорости потока для КЭХ и µ-ВЭЖХ представлена наРисунке 4.В КЭХ можно использовать более высокие скорости потока дляуменьшения времени анализа, поскольку значение ВЭТТ (см.
Рисунок 4)возрастает в меньшей степени с увеличением линейной скорости по сравнению сгидродинамическим потоком на кривой Ван-Деемтера.Таким образом, сочетание механизмов электрофоретической миграции ихроматографическогоразмывание зоны пробы.удерживанияпозволяетзначительноуменьшитьВысота эквивалентнаятеоретической тарелке (H), мкм16605040ВЭЖХ30КЭХ20100012345678Линейная скорость потока, см/минРис. 4. Сравнение кривых Ван-Деемтера в условиях КЭХ и ВЭЖХ.Колонка:поли(акрилметакрилат)монолит,содержащийсульфогруппы;длина 41.5см (8,5 см от окна детектора до конца капилляра); подвижная фаза, 20%(по объему) буфер фосфат натрия (5 мМ, рН 7) и 80% (по объему) ацетонитрил;температура, 21 оС; ввод, 5 кВ 3 с; детектирование, 205 нм; проба: тиомочевина[5].Необходимо отметить, что классическую теорию хроматографии можноиспользовать только для описания миграции нейтральных аналитов в КЭХ.Механизмэлектрохроматографическогоразделениянейтральныхвеществаналогичен хроматографическому и основан на распределении компонентов пробмежду двумя фазами.
Для заряженных веществ механизм разделения болеесложный.Принято считать, что разделение пептидов и белков в КЭХ возможноблагодарясовмещениюпроцессовхроматографическогоудерживанияиэлектрофоретической миграции. Механизм разделения заряженных белков ипептидов методом КЭХ был описан с использованием модели беспорядоченногодвижения [6].17В литературе рассматривается несколько уравнений для миграцииразделяемых веществ в КЭХ [7-12]. В одном из них, предложенном Хорватом [7,10, 11], лежит предположение о независимости процессов хроматографическогоразделенияиэлектрофоретическоймиграции.Миграционноеповедениезаряженных компонентов (белков, пептидов) описано в трех различных режимахразделения:-сонаправленнаяКЭХ,вкоторойэлектрофоретическаямиграциякомпонентов осуществляется в том же направлении, что и ЭОП;- противоположнонаправленная КЭХ, где электрофоретическая миграциякомпонентов осуществляется против движения ЭОП;- КЭХ смешанного типа, где аналиты движутся в обоих направлениях.Скорость миграции компонентов пробы можно выразить уравнением (7):,(7)где uКЭХ – общая скорость миграции, определяемая из электрофореграммы[см/мин];uЭФ,КЭХ – электрофоретическая скорость аналита в КЭХ [см/мин];k’1c – хроматографический фактор удерживания.Уравнение (7) можно записать иначе, используя электрофоретическиеподвижности аналитов (8):,(8)где µКЭХ – общая электрофоретическая подвижность, определяемая изэлектрофореграммы [см/(мин*В)];18µЭОП – электрофоретическая подвижность электроосмотического потока[см/(мин*В)];µЭФ, КЭХ – электрофоретическая подвижность аналита в КЭХ [см/(мин*В)];k’1c – хроматографический фактор удерживания.При сонаправленном режиме разделения в уравнениях (7) и (8) знак взнаменателе - положительный.
В случае противоположнонаправленного процесса– отрицательный.Выражениедляэлектрофоретическойподвижностианалитаможнопредставить следующим образом (9):(9),,где k’КЭХ – электрохроматографический фактор миграции компонента. Онсвязанс хроматографическимфакторомудерживания( k КЭХ ) следующим'выражением:(10),,где µr – исправленная подвижность, введенная Кеннделом [13]:,(11)Из уравнений (10) и (11) видно, что µr характеризует относительный вкладсобственной электрофоретической миграции в общую миграцию. Если веществоне имеет собственной электрофоретической подвижности (µr =0), тогда общаямиграция определяется только хроматографическим процессом, т.е.
k’КЭХ = k’1c.С другой стороны, если аналит не удерживается, т. е. k’1c= 0, тогда k’КЭХ=µr,т.е. разделение веществ определяется лишь его электрофоретической миграцией.19При достаточно сильном электрическом поле, ионизированные компонентыобразца, будут мигрировать, сорбируясь на поверхности ионизированнойстационарной фазы. В [2] введены три взаимосвязанных безразмерных параметра:,(12)где α – уменьшение подвижности компонентов образца по сравнению сэлектроосмотической подвижностью (um);βКЭХ – фактор удерживания в КЭХ,βlC – фактор удерживания в изократическом режиме ВЭЖХ,определяющиеся уравнениями (13) и (14), соответственно;γ – соотношение скоростей поверхностной электродиффузии(ues) иэлектрофоретической миграции(uem).(13),(14),Сочетаниеэлектрофоретическоймиграциивподвижнойфазеиповерхностной электродиффузии в стационарной фазе делает метод КЭХуникальным для разделения пептидов и белков.
Значимость вкладов вхроматографическое удерживание и электрофорез зависят от величин параметровмиграции α, β и γ в уравнении (12).Важной задачей является разработка новых стационарных фаз для КЭХ,способных предотвратить необратимую адсорбцию аналитов и при этом обладатьвысокой и равномерной плотностью заряда на поверхности стационарной фазы сцелью достижения оптимальных электрокинетических свойств колонки. В [6]предложено для достижения высокой скорости разделения регулироватьдавление, не снижая при этом эффективность колонки и селективности.201.2.
PLOT-колонки в капиллярной электрохроматографииВ настоящее время для разделения компонентов сложных смесей методомкапиллярной электрохроматографии (КЭХ) активно используются полые колонкис иммобилизованным пористым слоем монолитного полимера, т.
н. PLOTколонки (porous-layer open-tubular).Несмотря на то, что электрохроматография предложена Преториусом более30 лет назад [14], лишь недавно удалось оценить по-настоящему достоинстваэтого метода. Поскольку колонки – наиболее важная часть КЭХ-разделительнойсистемы, особое внимание уделяется технологии их изготовления. Метод КЭХсочетает достоинства высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) икапиллярного зонного электрофореза (КЗЭ). Опыт, имеющийся в ВЭЖХ,востребован и при изготовлении колонок, заполненных частицами илимонолитной стационарной фазой; развитие метода КЗЭ инициировало созданиеполых OT-колонок (open-tubular column) [15].Впервые ОТ-колонки для КЭХ описаны Tsuda и др.
в 1982 г. [16]. Полыеколонки с пористым слоем (PLOT – колонки) представляют подгруппукапиллярных колонок, на стенках которых иммобилизован пористый полимерныйматериал. Вначале они использовались в газовой хроматографии (ГХ) [17]. Вусловиях жидкостной хроматографии из-за низкой диффузии аналитов кфункционализированнымстенкамкварцевогокапилляра,приводящейкзаметному размыванию хроматографических зон и, соответственно, снижениюэффективности, они не получили достаточно широкого распространения[18].Теоретические расчеты показали, что влияние диффузии становитсянезначительным в капиллярах с диаметром < 15мкм [19].
В методе КЭХиспользование высоких давлений не требуется: подвижная фаза мигрирует за счетэлектроосмотического потока (ЭОП). Слой пористого полимера в PLOT-колонкахобеспечивает более высокую площадь поверхности, чем в обыкновенныхкапиллярах, хотя в сравнении с набивными и монолитными аналогами площадь21поверхности в слое полимера несколько ниже. Несмотря на высокуюпроницаемость капиллярных PLOT-колонок, их получение и применение в КЭХменее распространено [20]. В принципе, полимерные монолитные слои имеютмного общего с монолитными КЭХ-колонками [21]. Единственное различиесостоит в том, что пористый материал не полностью заполняет весь внутреннийобъем капилляра.Важным направлением в активно развивающейся в настоящее времяпротеомике является электрофоретическое определение белков в сложныхбиологических матрицах.
Перспективным для решения этой задачи сталоиспользование полых колонок благодаря их высокой эффективности, легкостиавтоматизации, малым расходом реагентов и образцов [22-25]. Однако впротеомическом анализе использование КЭХ с полыми колонками ограниченонеобратимой сорбцией белков стенками непокрытого кварцевого капилляра ивозможнымиэлектростатическимиионогеннымифункциональнымивзаимодействиямигруппамимеждусорбента,белкамииформирующимиэлектроосмотический поток (ЭОП) [26].Рекомендовано использование модифицированных неподвижных фаз,содержащих гидрофобные объемные группы, предотвращающие нежелательныйконтакт молекул белков с заряженными функциональными группами сорбентаили отрицательно заряженными силанольными группами на внутреннейповерхности стенок кварцевого капилляра [27,28].В [29] для этой цели применяли разветвленный полиэтиленимин (PEI) –катионный полимер с полярными первичными, вторичными и третичнымиаминогруппами (Рисунок 5).
Большое количество протонированных аминогруппобеспечивает значительный (1.98х10-4см2/с*V) отрицательный ЭОП и селективноевзаимодействие с аналитами.22Рис. 5. Схема получения стационарной фазы на основе разветвленногополиэтиленимина щеточного типа [29].Недостатком OT-КЭХ является небольшое число функциональных групп,ковалентно связанных с внутренней стенкой кварцевого капилляра и доступныхдля модификации [30,31].Длятогочтобыполучитьсорбентспособностью,используютразличныесинтетическаяхимическаямодификацияграфтирование(прививкасподходы:реакционнойсополимеризация,ранее полученногореакционно-способныхповерхность синтезированных матриц).необходимойполимерныхпост-полимера ицепейна23Одним из интересных способов увеличения лигандной емкости прихимической модификации внутренней поверхности капилляра является т.н.графтинг [32]: функциональные цепи («щетки», или «щупальцы») формируютсяна активных центрах поверхности.Широко описан метод фотоинициируемого графтирования, используемогодля химической функционализации макропористых полимерных материалов [33,34].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
