Диссертация (1150384), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Деионизированная вода, спиртэтиловый (99,5%, VWR prolabo); гидроксид аммония (30%-ый водный раствор,Acros organic); перекись водорода (30%-ый раствор, ч.д.а, Merck); борная кислота(х.ч.) («Реахим»); дигидрофосфат натрия (Sigma-Aldrich, 99%); фосфорнаякислота (85%-ый раствор); лимонная кислота (Sigma-Aldrich, 99.5%).2.3. Пробоподготвка биологических жидкостей к анализу2.3.1.
Фильтрация пробыПробу (сыворотка крови, моча) последовательно фильтровали черезбумажный и стекловолоконный фильтр с размером пор 1-2 мкм, а затеммембранный (инертный к белкам) микрофильтр с размером пор 0,22 мкм.Далее пробу мочи подвергали обессоливанию и депигментацию.2.3.2. Пробоподготовка мочи к анализу альбуминаПроводилосьобессоливаниеидепигментацияпредварительноотфильтрованного образца с помощью самопроточной мини-колонки с гелем,типа SephadexG50, который имеет предел исключения по белкам М=10000.
НаРисунке 35 проиллюстрирован процесс выделения белковой фракции.В мини-колонку (с объемом слоя геля 7 мл) вносили 2,5 мл мочи, промываливодой, первые 2,5 мл элюата отбрасывали, а следующие 3,5 мл собирали.Собранныйобразецдегазировалиподультразвукомиподвергалиэлектрофоретическому анализу. Весь процесс пробоподготовки занимал 10 мин,63причем несколько проб можно было обрабатывать одновременно на серииСоли и пигментыидентичных миниколонках (Рисунок 35).ПробаРис. 35. Пробоподготовка мочи к анализу: быстрое обессоливание идепигментация. Самопроточный гель-фильтр с объемом слоя 7 мл; объем пробы2,5 мл; слив 2,5 мл; сбор белковой фракции 3,5 мл.Выход белка 95 % ; разбавление пробы : в 1.4 раза.Концентрированиепробы,обеспечивающеенеобходимыйуровеньчувствительности УФ детектирования по альбумину, проводили на начальнойстадии электрофоретического анализа.
Для этой цели применялись различныеварианты on-line концентрирования.642.4. Методы исследования2.4.1. Капиллярная электрохроматография с использованием монолитных иPLOT-колонок2.4.1. 1.Синтез полиметакрилатных капиллярных колонокНа первом этапе осуществляли травление кварцевого капилляра (промывкав течение 30 мин 1М раствором NaOH), герметизировали, помещали в термостат(120°С; 2 ч); далее последовательно промывали дистиллированной водой (15 мин)и 0,1М раствором HCl (15 мин); снова водой (15 мин) и ацетоном (15 мин); затемсушили в токе азота (2 атм в течении часа; 120 °С) [86].После этого проводили силанизацию кварцевого капилляра. Для этогокварцевый капилляр промывали водным раствором, содержащим 20% (объемн.)триметоксисилилпропилового эфира метакриловой кислоты, 30% уксуснойкислоты (1%-ный раствор); заклеивали концы герметиком; и оставляли на суткипри комнатной температуре; затем капилляр промывали ацетоном (15 мин) ипродували током азота (30 мин).Синтез монолитной капиллярной колонкиВэппендорф(1мл)помещалиглицидилметакрилат(200мкл),метилметакрилат (200 мкл) и этиленгликольдиметакрилат 400 мкл, инициатор азо-бис-изобутиронитрил (0,006 г) и, наконец, смесь порогенных растворителейпропанол-1 (200 мкл) и формамид (1000 мкл).Капиллярпромывалиполимеризационнымраствором(30мин),герметизировали и термостатировали (при 65°С в течение 3 ч и при 78°С втечение 16 ч); затем промывали ацетоном (150 мкл/мин; 200-300 атм в течение 30мин); сушили в токе азота (2 атм; 2 ч).PLOT-метакрилатная капиллярная колонка65В эппендорфы на 2 мл добавляли 40-80 мкл глицидилметакрилата, 40-80мкл метилметакрилата и 80-160 мкл этиленгликольдиметакрилата, а затемрастворяли 0,00096 г (0,3% от смеси мономеров) азо-бис-изобутиронитрила.Далее прибавляли смесь порогенных растворителей, состоящую из 280-293 мклпропанола-1 и 1400-1467 мкл формамида.Предварительносиланизированныйкварцевыйкапиллярпромывалиполимеризационным раствором в течение 30 мин, герметизировали и помещали втермостат при 70°С на 3.
Капилляры промывали ацетоном (скорость потока – 150мкл/мин, давление – 200-300 атм) в течение 30 мин, сушили в токе азота ( 2 атм) втечение 2 ч.Постфункционализацию метакрилатного полимера проводили следующимобразом:промывалибутилэтиламином(30минпри150-200атм),герметизировали и выдерживали в термостате (8 ч при 70°С); далее промывалиацетоном (30 мин), водой (150-200 атм) и заполняли фосфатным буфернымраствором при тех же условиях.Затем в подготовленном капилляре прожигали окно детектирования пропанбутановым пламенем. Далее капилляр промывали фосфатным буфернымраствором (1 ч) с использованием насоса (50мкл/мин; 150-200 атм) и затем втечение 3 ч - электрокинетически (15кВ).2.4.1.2. Синтез PLOT-PEI-Mal капиллярной колонкиТравление кварцевого капилляра. Кварцевый капилляр промывали изаполняли 1М раствором NaOH. Заполненный капилляр герметизировали инагревали в термостате при 100°C в течение 2 ч. После охлаждения до комнатнойтемпературы капилляр промывали 0,1 М раствором HCl в течение 5 мин,деионизированной водой 10 мин и ацетоном 15 мин, сушили в термостате при120°C в токе азота (2атм) в течение 1 ч.66Силанизация кварцевого капилляра.
Протравленный капилляр промывалираствором, дегазированным в течение 15 мин в ультразвуковой бане, содержащим30% (объемн.) (3-глицидоксипропил)триэтоксисилана и 0,01% (масс.) 2,2дифенил-1-пикрилгидразила в N,N-диметилформамиде (ДМФА). Заполненныйкапилляр герметизировали и нагревали в термостате при 120°C в течение 6 ч.Затем интенсивно промывали ДМФА, метанолом и высушивали в токе азота.Функционализация силанизированного капилляра.Силанизированныйкапилляр заполняли дегазированным в ультразвуковой бане (10 мин) растворомPEI-Mal B – сверхразветвленного полиэтиленимина, функционализированногомальтозой, (0,015 г/мл в воде), герметизировали концы и оставляли на 48 ч прикомнатной температуре, затем промывали водой.2.4.1.3.
Разделение белков методом капиллярной электрохроматографии(КЭХ)Условия электрофоретического анализаВвод пробы: а) гидродинамический (0,05 атм) или элетрокинетический (11000 мбар·с); б) электрокинетический (10 кВ). В качестве маркера ЭОПиспользовали 6%-ый раствор диметилсульфоксида в соответствующем рабочемэлектролите.
Рабочее напряжение в начале работы постепенно меняли с -7кВ до 20кВ;анодсостороныокнадетектирования.Спектрофотометрическоедетектирование осуществляли при λ=214нм. Электрокинетический ввод пробы, 10кВ. Воздушное термостатирование колонки +20ºС. Рабочий электролит – 10 –55мМ фосфатный буферный раствор (4,872 г NaH2PO4 и 1,65 мл 85%-ной H3PO4на 1 л дистиллированной воды).ВкачествемаркераЭОПиспользовали0,2%(объемн.)раствортиомочевины в соответствующем рабочем буферном растворе. Перед началомработы промывали монолитную колонку ацетонитрилом (30 мин) для удаления67пузырьков воздуха, между опытами, а после окончания работы – рабочимэлектролитом (30 мин).Определение скорости электроосмотического потока (ЭОП)Кварцевый капилляр в течение 300 с промывался рабочим электролитом,затем электрокинетически (2с × 10 кВ) вводился 0,2 %-ый раствор ДМСО вбуферном растворе.
Монолитную колонку в течение 300 с промывали 27,5 мМфосфатнымбуфернымраствором,содержащим50%ацетонитрила.Электрокинетически (5с × 10 кВ) вводился раствор, содержащий миоглобин,лизоцим, инсулин и альбумин (концентрация каждого белка составляла 1 мг/мл) в27,5 мМ фосфатном буферном растворе.2.4.2. Синтез динамически модифицированной дендритной капиллярнойколонкиКварцевый капилляр последовательно промывали 1М раствором NaOH втечение 30 мин, затем дистиллированной водой 15 мин, 1М раствором солянойкислоты 30 мин и снова дистиллированной водой 15 мин. Протравленныйкапилляр заполняли дегазированным в ультразвуковой бане (10 мин) растворомPEI-Mal (0,015 г/мл в воде), герметизировали концы кварцевого капилляра иоставляли на 2 ч при комнатной температуре, затем промывали дистиллированнойводой.
Электрофоретический анализ проводили с использованием 75 мМборатного буфера (рН 10,2) без введения сверхразветвленного полимера.2.4.3. Мицеллярная электрокинетическая хроматографияПеред началом работы и по ее окончанию кварцевый капилляр промывали0,1 М раствором HCl (5мин), дистиллированной водой (5 мин), 0,1М воднымраствором NaOH (5 мин), снова водой и рабочим электролитом с добавкойполимера PEI-Mal (0,5÷8 мг) (5мин). Между опытами капилляр промывалидистиллированной водой в течение 5 мин.682.4.4. Капиллярный электрофорез смеси стандартов белковПеред началом работы и между опытами кварцевый капилляр промывали 0,1 Мраствором HCl (10мин), дистиллированной водой 5 мин, водным растворомщелочи (0,1М NaOH) в течение 5 мин, снова водой и рабочим электролитом(5мин).
По окончанию работы капилляр промывали дистиллированной водой (5мин).Электрофоретическоеразделениебелковпроводилинакварцевомкапилляре с внешним защитным полиимидным покрытием (внутренний диаметр –50 мкм, наружный диаметр – 360 мкм, общая длина – 45 см); рабочее напряжение20кВ,катодсостороныокнадетектора.Спектрофотометрическоедетектирование осуществляли при λ=214 нм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
