Диссертация (1150384), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Так, в [69]предлагается использовать аффинную хроматографию для удаления из сывороткикровиальбуминаииммуноглобулина,содержащихсявзначительныхколичествах. Альтернативой гель-электрофорезу являются методы капиллярногоэлектрофореза: мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ),капиллярный гель-электрофорез (КГЭ), капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ)и капиллярная электрохроматография (КЭХ) [70,71].Разделение в МЭКХ основано на распределении аналитов между буфернымраствором и мицеллами (псевдостационарной фазой) посредством гидрофобныхвзаимодействий, ионных и водородных связей [72].В методе КГЭ разделение проводится в заполненном гелем капилляре помеханизму эксклюзионной хроматографии. Его применяют для разделениясоединений с очень близким соотношением заряд/размер молекулы.1.4.
Метод эллипсометрии для контроля сорбции белковИзвестно, что многие белковые молекулы являются маркерами различныхзаболеваний.Дляуспешнойдиагностикитребуетсяихколичественноеопределение. Необратимая адсорбция белков на стенках кварцевого капилляра впроцессе электрофоретического разделения аналитов может искажать результатыанализа. Метод эллипсометрии неоднократно и успешно использовался дляизучения адсорбции различных веществ из газовой и из жидкой фаз.Эллипсометрия – недеструктивный оптический метод, применяемый дляхарактеристики поверхностей и тонких пленок, т.
е. для определения такихпараметров, как показатель преломления, коэффициент экстинкции, толщинапленок. Одно из главных его достоинств - высокая чувствительность,позволяющая измерять толщину пленок на уровне нескольких нм [73].Эллипсометрия является удобным и перспективным методом в области45биоаналитики, например, при изучении процессов адсорбции белков, выявленииспецифических взаимодействий и др.Основы метода подробно изложены в [73, 74]. Принципиальная схемаэллипсометрапредставленанаРисунок27.Пучоксвета,испускаемыйисточником, проходит через поляризатор и компенсатор; попадает на образец,далее проходит через анализатор и, в итоге, достигает детектора, которыйизмеряет интенсивность света [74].Рис.
27. Принципиальная схема эллипсометра, где P-поляризатор, Cкомпенсатор, A-анализатор [74].Падающий на поверхность пучок света может отражаться и преломляться.Угол отражения ϕr равен углу падения (Рисунок 28). Угол преломления ϕt зависитот показателя преломления (n) вещества в соответствии с законом Снэлла (15):,(15)Световая волна изменяется после прохождения слоя вещества из-заизменения показателей преломления (16):,(16),где c – скорость света в вакууме (м/с) и v – скорость света в среде споказателем преломления n (м/с).46Рис. 28. Схема взаимодействия луча с веществом.n0 – показатель преломления окружающей среды;n1 – показатель преломления вещества;ϕi – угол падения, ϕr – угол отражения;ϕt – угол преломления.В основе метода эллипсометрии лежит изменение состояния поляризациисветовой волны при её отражении от поверхности. Экспериментально измеряемыеэллипсометрические параметры и описывают амплитудные и фазовыеизменения волны.
Эти параметры связаны с комплéксными коэффициентамиотражениядляволн,поляризованныхвплоскостипадения(Rp)иперпендикулярно ей (Rs) следующим соотношением (17):,(17)Коэффициенты отражения (Rp, Rs)зависят от показателя преломлениявнешней среды (n0), оптических постоянных i-х слоёв исследуемой структуры(показатель преломления (ni), коэффициент экстинкции (ki), толщин (di)),подложки (ni, ki), а также угла падения ( ) и длины волны (света (17).47После отражения и преломления луч света меняет форму поляризации.
Этотэффект регистрируется методом эллипсометрии: контролируется изменениесостояния поляризации света, отраженного от поверхности. В связи с изменениемамплитуды и фазы после взаимодействия с поверхностью падающий линейнополяризованный свет становится эллиптически поляризованным, отсюда иназвание метода (Рисунок 29).Рис. 29.
Взаимодействие пучка света с поверхностью в эллипсометрии.Символы Ej и Er указывают плоскости, в которых линейно поляризованный светколеблется перпендикулярно (p) и параллельно (s) к плоскости падения [75].В методе эллипсометрии измеряется изменение в состоянии поляризациипадающего (i) и отраженного (r) света посредством определения значенияпараметра tan ψ – отношения амплитуд световой волны до и после отражения всоответствии с уравнением (18); Δ – относительная разность фаз колебаний этойволны (19):(18)(19)где Е– амплитуда световой волны; δ – фаза колебаний волны.48Таким образом, в основе метода эллипсометрии лежит измерение значенийэллипсометрических углов (Ψ и Δ).В случае многослойной структуры пучок света отражается и преломляетсяот каждого слоя, поэтому световая волна на выходе является суперпозицией волн(Рисунок 30).ВнешнийслойПленкаВеществоРис.
30. Множественное отражение и преломление в материале. ϕi- уголпадения, ϕt-угол пропускания, d-толщина.Комплéксный показатель преломления (N) состоит из вещественной(показатель преломления, n) и мнимой частей (коэффициент экстинкции, k) изависит от длины волны (20):(20)Коэффициент экстинкции (k) относится к веществам, поглощающим светпри прохождении луча через вещество. Для непоглощающих соединенийпоказатель преломления не является комплéксным. Толщина измеряемой пленки(d) и оптические константы (показатель преломления и коэффициент экстинкции)оцениваются путем сравнения измеренных величин Ψ и Δ с такими жевеличинами, заданными для модели оптического слоя.Логика такого подхода представлена на Рисунок 31.49Рис.
31. Основные этапы анализа методом эллипсометрии [74].Задаются значения параметров d и n, если k=0 (т. е. для пленок, непоглощающих свет), чтобы использовать их для дальнейших вычислений. Сучетом введенных данных измеряются значения параметров Ψ и Δ и сравниваютсяс заданными для модели.
Подбор продолжается до тех пор, пока не будут найденызначения,максимальноудовлетворяющиеэкспериментальнымданным.Наименьшее значение функции ошибки соответствует наиболее вероятнымзначениям искомых параметров оптической модели для всех m точек спектра (21):(21)В случае тонких слоев (d < 10-20 нм) нецелесообразно определятьодновременно толщину и показатель преломления пленки из-за имеющейсякорреляции между ними. Поэтому рекомендовано использовать известные(справочные) постоянные показателя преломления и измерять только значениетолщины пленки[73, 74].Все вышесказанное свидетельствует о простоте и надежности методаэллипсометрии как инструмента контроля сорбции белков на поверхностисверхразветвленных полимеров.501.5.
Методы on-line концентрирования в капиллярнойэлектрохроматографииРазработка и использование методов on-line концентрирования для анализаследовых количеств веществ существенно расширяет аналитические возможностиметода капиллярного электрофореза, позволяя получать сопоставимые свысокоэффективнойжидкостнойхроматографией(ВЭЖХ)отношениясигнал/шум. Одни из них основаны на изменении электрофоретическихподвижностей аналитов за счет варьирования концентрации и рН буферногоэлектролита или же введения в состав последнего комплексообразующихдобавок; другие - на использовании дополнительной (псевдостационарной) фазы,роль которой могут выполнить вещества, способные формировать мицеллы имикроэмульсии [76].Изизвестныхвариантовon-lineконцентрированиявкапиллярномэлектрофорезе выделяют в качестве основных: стэкинг (stacking), изотахофорез(transient isotachophoresis, t-ITP), динамический рН-скачок (dynamic pH junction) исвипинг(sweeping).Восновекаждоголежитопределенныймеханизмконцентрирования, обусловленный различием свойств раствора пробы и рабочегобуфера [76].Для количественной оценки степени концентрирования введен факторэффективностиконцентрирования(SEF-stackingefficiencyfactor),рассчитываемый по отношению к высоте (SEFheight) или площади пиков (SEFArea):где Δ – коэффициент разбавления.Однимизнаиболееобщихподходоввнутрикапиллярного концентрирования является стэкинг.электрофоретического511.5.1.
СтэкингРазличают несколько вариантов стэкинга [76].Стэкинг с усилением поля (FASS – field-amplified sample stacking)Он активно используется в КЗЭ при определении низких концентрацийаналитоввклиническихлабораторияхиоснованнаразличиивэлектропроводности матрицы образца и рабочего буфера. Анализируемая пробагидродинамически вводится в кварцевый капилляр из раствора меньшейэлектропроводности, чем электропроводность рабочего буфера. Ионы образца врастворесболеенизкойпроводимостьюимеютповышеннуюэлектрофоретическую подвижность, чем в рабочем буфере.
Когда приложенонапряжение, в зоне пробы возникает сильное электрическое поле, и аналитыдвижутся с более высокой скоростью (Рисунок 32А). Достижение границырабочего буфера вызывает замедление скорости аналитов, и они концентрируютсявузкиезоны(Рисуноксконцентрированныезоны32Б).Когдаподвергаютсяградиент проводимостиобычномуисчезает,электрофоретическомуразделению [77].Такойвариантреализуетсядлякатионовианионов:первые-концентрируются в начале зоны пробы; анионы – в конце. Для концентрированияи последующего определения катионов используют положительную полярностьэлектродов, а для анионов, наоборот, – отрицательную.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
