Диссертация (1150384), страница 2
Текст из файла (страница 2)
К последним относятся и новые водорастворимыеполимеры на основе сверхразветвленного полиэтиленимина, содержащеготерминальные олигосахаридные фрагменты [1]. Легкость их модификациипозволяет контролировать растворимость, реакционную способность, адгезию кповерхности, увеличивать биосовместимость, изменять комплексообразующиесвойства. Наличие внутримолекулярных полостей обеспечивает им способностьобразовывать комплексы включения типа «гость-хозяин» с аналитами различнойприроды [1]. В диссертационной работе выявляется способность этих полимеров,введенных в состав рабочего буфера, влиять на миграционные характеристикибелков и препятствовать их сорбции в процессе их электрофоретическогоразделения.Другая проблема, возникающая при электрофоретическом определениибелков – высокие пределы обнаружения аналитов, затрудняющие использованиеметода КЭХ в практике клинической медицины. Ее решением мог бы быть поиски/илиразработкановыхвариантовon-lineконцентрирования,включаякомбинирование различных механизмов, позволяющих получать сопоставимые свысокоэффективнойжидкостнойхроматографией(ВЭЖХ)отношениясигнал/шум.Эти задачи ставятся и решаются в данном диссертационном исследовании.7Цель диссертационного исследованияОценить аналитические возможности дендритных полимеров типа «ядрооболочка» на основе полиэтиленимина с мальтозной оболочкой в качествестационарных и псевдостационарных фаз в капиллярном электрофорезе ипредложить варианты внутрикапиллярного концентрирования для определениябелков в биологических жидкостях.В связи с поставленной целью необходимо было решить задачи:1.ОценитьсинтезированныхвоспроизводимостькапиллярныхианалитическиемонолитныхихарактеристикиPLOT-колонокнаосновеметакрилатов и сверхразветвленных полимеров при различных значениях pHрабочего электролита на примере разделения модельной смеси белков.2.Получитьэкспериментальноеподтверждениеролисверхразветвленных полиэтилениминов, функционализированных мальтозой вразличной степени, в качестве стационарных и псевдостационарных фаз вусловияхмицеллярнойэлектрокинетическойхроматографии(МЭКХ)икапиллярной электрохроматографии (КЭХ).3.Выявитьвозможностидендритныхполимеровпредложитьвариантвсоставеon-lineконцентрированиясэлектрохроматографическихвнутрикапиллярногоконцентрированиясучастиемсистемипределамиобнаружения, позволяющими определять белки на уровне их содержания вбиологических жидкостях.4.внутреннейМетодом эллипсометрии оценить возможность адсорбции белков наповерхностиPLOT-колонки,модифицированнойдендритнымполимером.5.Апробировать установленные закономерности на реальных объектах(сыворотка крови, моча).8Научнаяновизна.Методомкапиллярнойэлектрокинетическойхроматографии установлен факт динамической модификации стенок кварцевогокапилляра при введении сверхразветвленных полиэтилениминов с мальтознойоболочкой в состав рабочего буфера, что позволяет увеличить воспроизводимостьпараметров миграции и обеспечить эффективность до 4×105 т.т./м при групповоманализе белков.Показано, что в качестве оценочного контроля сорбции белков навнутреннейповерхностиPLOT-колонок,модифицированныхдендритнымполимером, может быть использован метод эллипсометрии.Выявлены возможности различных вариантов on-line концентрированияальбумина,лизоцима,модифицированныхинсулинаиолигосахариднымимиоглобинапроизводныминаPLOT-колонках,сверхразветвленногополиэтиленимина и установлено, что сочетание электростэкинга и стэкинга сбольшим объемом вводимого образца обеспечивает концентрирование белков сфакторами концентрирования 900 – 1320.Практическая значимость работы.
Предложена технология подготовкиPLOT-колонок на основе метакрилатных полимеров и мальтозилированныхсверхразветвленныхвоспроизводимостьюполиэтилениминов,покрытияихарактеризующихсяпараметрамимиграциивысокойаналитов(дляметакрилатных и дендритных полимеров RSD = 0,8 и 0,5%, соответственно).Методом эллипсометрии предложен оценочный контроль сорбции белковна внутренней поверхности PLOT-колонок, модифицированных дендритнымполимером.Установлено,чтоиспользованиеPLOT-колонокнаосновеполиэтилениминового сверхразветвленного полимера с мальтозной оболочкойобеспечивает снижение предела обнаружения белков до 0,1 мкг/мл (факторконцентрирования >1000).9Предложен вариант электрофоретического определения альбумина вбиологических жидкостях (сыворотка крови, моча) с электрокинетическимвводом (ввод пробы: 90 с×15 кВ) на уровне диагностически-значимыхконцентраций.Степень достоверности и апробация результатов настоящей работыподтверждается хорошей воспроизводимостью всех полученных результатов, ихсогласованностью при использовании независимых методов исследования.На защиту выносятся следующие положения:1.Увеличениевоспроизводимостипараметровмиграциииселективности разделения белков за счет использования в качестве стационарнойи псевдостационарной фаз сверхразветвленных полиэтилениминов с различноймассой ядра и степенью модификации мальтозой при разделении белков методоммицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ).2.Комбинированныйэлектрофоретическийвариантon-lineконцентрирования, основанный на сочетании электростэкинга со стэкингом сбольшим объемом образца без переключения полярности и реализованный наPLOT-колонках, содержащих дендритные полимеры в качестве стационарныхфаз.
Снижение пределов обнаружениябелковна уровне их содержания вбиологических жидкостях.3.Оценочный контроль сорбции белков на внутренней поверхностиPLOT-колонки,модифицированнойдендритнымполимеромметодомэллипсометрии.4.Схемаэлектрофоретическогоопределенияальбуминавбиологических жидкостях (моча, сыворотка крови) с применением стационарныхфаз на основе мальтозилированного сверхразветвленного полиэтиленимина.10ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР1.1. Основы капиллярной электрохроматографииКапиллярная электрохроматография (КЭХ) – активно развивающийсягибридный метод разделения, позволивший существенно расширить возможностисовременной аналитической химии.
Специфика метода КЭХ в отличие от ВЭЖХсостоит в том, что гидродинамический поток подвижной фазы заменяетсяэлектроосмотическим потоком (ЭОП), формирующимся в капиллярной колонкепри наложении внешнего электрического поля.Различные механизмы, определяющие разделение компонентов смеси вклассическойхроматографии,капиллярномзонномэлектрофорезе(КЗЭ),изоэлектрической фокусировке и изотахофорезе, фактически объединены в одномметоде - КЭХ, и каждый из вышеперечисленных - привносит элементы своиххарактерных закономерностей в итоговый процесс разделения. Это значительноувеличивает потенциальные возможности КЭХ как метода разделения и анализасмесей. Например, стало возможным комбинировать обращенно-фазовое илиионообменное разделение с дифференцированной электромиграцией аналитов.Кроме того, в режиме КЭХ возможно разделение смесей нейтральныхсоединений,следовательно,онявляетсяальтернативоймицеллярнойэлектрокинетической хроматографии (МЭКХ).Вкапиллярнойэлектрохроматографии(КЭХ)движениежидкостиосуществляется под действием электрического поля, что гораздо эффективнее,чем применение давления, как в случае ВЭЖХ.
Такое специфическое поведениедвижущегосяпотоканазываетсяэлектроосмотическимпотоком(ЭОП)(Рисунок 1).Электроосмотический поток в КЭХ возникает за счет образования двойногоэлектрическогослоя(ДЭС).Поэтомуприоценкеэлектрофоретической11подвижности аналитов необходимо учитывать такие характеристики какпористость и проницаемость колонки.Большинство теоретических работ по КЭХ основано на предположении, чтокапиллярную колонку, заполненную пористым сорбентом, можно в первомприближении, рассматривать, как систему параллельных капиллярных трубок,каждая из которых ведет себя подобно обычному капилляру в капиллярномзонном электрофорезе (КЗЭ) с ζ-потенциалом стенок, равным ζм -потенциалуповерхности сорбента [2].Рис.
1. Движение жидкости в капилляре под действием приложенногоэлектрического поля.Скорость движения электроосмотического потока зависит от свойствэлектролита:вязкость,диэлектрическаяпроницаемость,потенциалнаповерхности внутренней стенки капилляра или монолита (т.н. дзета-потенциал, ζ).Линейную скорость ЭОП можно описать уравнением Смолуховского [2](1):(1),где uЭОП – линейная скорость ЭОП [см/мин];ε0– диэлектрическая проницаемость среды в вакууме;12εв– относительная диэлектрическая проницаемость вещества;η – вязкость среды [м²/с];E – напряженность электрического поля [В];µЭОП – подвижность ЭОП [см2/В*с].Уравнение описывает движение жидкости вблизи заряженных стеноккапилляра. Для пористых монолитов в КЭХ рассматривают иную модель ЭОП,скорость которого в заполненных капиллярных колонках задается уравнением (2)[2]:,(2)где uср– средняя скорость ЭОП [см/мин];uэоп – скорость электроосмотического потока, создаваемая монолитом (см.уравнение (3) [см/мин];dч– диаметр частиц сорбента [мкм];R– радиус капиллярной колонки [мкм];ζкап– дзета-потенциал стенок капилляра;ζм– дзета-потенциал на поверхности монолита;β – безразмерный параметр (см.
уравнение (4)).,(3)где σ*/σкап – отношение коэффициентов проводимости заполненной колонки (σ*)и пустого капилляра (σкап).13,(4)εкол – общая пористость колонки;α – безразмерный параметр, который зависит от структуры монолита иформы частиц.Для оценки пористости сорбента и характеристики заполненной колонкииспользуют величину ( ) (5):*п,(5)Эта величина в идеальных условиях не зависит от свойств подвижной фазы(кроме тех случаев, когда на ионизацию электролита влияет неподвижная фаза),размера частиц, длины колонки и силы электрического поля.В электрическом поле катионы диффузного слоя мигрируют к катоду, уносяс собой сольватные оболочки. В результате движется вся жидкость, а поток имеетплоский профиль, в отличие от гидродинамического потока жидкости в ВЭЖХ,где ламинарный поток имеет параболический профиль (Рисунок 2).а)б)Рис.
2. Профиль потока в условиях электроосмоса (а), в условиях ВЭЖХ (б).14Дальнейшие исследования подтвердили правильность этого предположения[3]. Кроме того, профиль ЭОП зависит от диаметра капилляра (d ) и от величиныДЭС (δ). Проведенные теоретические расчеты в [3] выявили, что профиль будетплоским только в том случае, когда величина d » δ (показано, что профиль потокбудет преимущественно плоским при d ≥ 10δ).Чем ближе между собой значения dи δ, тем более параболическим будет профиль потока.Плоский профиль потока объясняет и большую эффективность в КЭХ посравнению с ВЭЖХ, которую можно оценить по уравнению Ван-Деемтера (6):(6),,где А – параметр, характеризующий вихревую диффузию.Он имеет меньшее значение в КЭХ по сравнению с -ВЭЖХ благодарянезависимости скорости ЭОП от геометрии каналов и диаметра частиц сорбента.Это, в свою очередь, позволяет в КЭХ увеличивать длину колонки, а размерчастиц уменьшить до субмикронного уровня, что и приводит в итоге кувеличению эффективности колонки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
