Диссертация (1150384), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Капиллярные полиметакрилатные монолитные колонкиПолучение полиметакрилатного полимера in situ включало травление исиланизацию поверхности кварцевого капилляра (Рисунок 38); полимеризацию вприсутствии порогенов (Рисунок 39) и последующую постфункционализациюполимерной поверхности (Рисунок 41).Силанизацияобеспечивалабольшуюсмачиваемостьповерхностигидрофобным раствором мономеров (Рисунок 38).Рис. 38.
Схема проводимой силанизации триметоксисилилпропиловымэфиром метакриловой кислоты.Реакционная смесь содержала глицидилметакрилат и метилметакрилат мономеры, и этиленгликольдиметакрилат в качестве сшивающего агента.Смесь метакрилатов растворяли в системе 10% пропанола-1 и 50%формамида для обеспечения оптимальной пористости колонки (Рисунок 39).OOCH3OH2C+CH3H2C CCCH3H2CCCOOAIBNOH2CCCOOCH3nCH3OOH2CCCOOH2CCH3CH3OOO CH2CH2OOOO CH2mH2C CH+CCH CH2OOCOrРис. 39. Схема получения полиметакрилатного монолитаCCH2CCH3s78Пористость полученного полимера контролировали методом сканирующейлазерной микроскопии.
Фотографии срезов монолитных колонок (приложение 1)обрабатывали в программе MathLab.На Рисунке 40 приведен график типичного распределения пор по площади.По результатам оценки пористости в подготовленных колонках содержится87,0±5,7% макро- и 13±4,7% микро-пор.Рис. 40. Распределение пор по площади в структуре монолита.Дляформированияэлектроосмотическогопотока(ЭОП)проводилиреакцию постфункционализации с N-бутилэтиламином (Рисунок 41).OOONH+OOONOHHONHOHРис. 41. Схема постфункционализации монолита с N-бутилэтиламином.793.1.2. Капиллярные PLOT-метакрилатные колонкиСледуя логике предыдущих экспериментов, были синтезированы также иPLOT-метакрилатные колонки.
Процедура их синтеза аналогична получениюмонолитных полиметакрилатных и отличается лишь меньшим количествоммономеров в полимеризационной смеси и условиями синтеза.Варьировали время полимеризации (1-4 ч) и соотношение между смесьюмономеров и порогенным растворителем, природу порогенного растворителя(октанол-1, пропанол-1, формамид).Оценку образования тонкого пористого слоя полимера проводили пофотографиям среза поверхности кварцевого капилляра, которые получали наконфокальном лазерном сканирующем микроскопе (LeicaTCSSL) при λвозб= 488нм (Рисунки 42, 43).Рис.
42. Фотография среза поверхности PLOT-колонки, полученная налазерном микроскопе LeicaTCSSL; λвозб 488 нм. Условия полимеризации: 700 С 3ч,порогенный растворитель – октанол-1.80а)б)в)Рис. 43. Фотографии среза поверхности PLOT-колонки, полученные налазерном микроскопе LeicaTCSSL; λвозб 488 нм.Условия полимеризации: 700 С а) 2,5ч и б) 3ч, порогенный растворитель –пропанол-1 (неравномерное покрытие капилляра); в) 700 С 4ч, порогенныйрастворитель – пропанол-1/формамид (1:5, объемн.) (образуется монолитныйсорбент).Показано,чтоиспользованиеоктанола-1вкачествепорогенногорастворителя позволяет получать PLOT-колонки с равномерным тонкимпористым слоем полимера при термической полимеризации в течении 2,5 ч.В случае пропанола-1 наблюдалось образование неравномерного слояполимера, тогда как с использованием смеси пропанол/формамид уже через 4 чобразуется монолитный сорбент, который полностью заполняет внутреннийобъем капилляра.81Выбраны условия: 16% смеси мономеров, 2,5 ч полимеризация при 70 0С,порогенный растворитель-октанол-1; эти условия в дальнейшем и былииспользованы нами для синтеза PLOT-колонок.3.2.
Электрохроматографическое разделение белков.Разделение смеси стандартов белков проводилось в кислой среде (pH 2,2;условия на Рисунки 10, 11). Поток жидкости в капилляре, заполненномположительнозаряженныммонолитнымсорбентом,генерируетЭОП,направленный к аноду. В этих условиях все белки модельной смеси заряженыположительно и электрофоретически мигрируют в противоположном поотношению к ЭОП направлению.С другой стороны, аналиты и поверхность монолитного сорбента имеютодноименные заряды. Это вызывает электростатическое отталкивание молекулбелков от поверхности сорбента, что исключает возможность их адсорбции.Однако, наличие слабых гидрофобных взаимодействий с функциональнымигруппами монолита способствует удерживанию компонентов пробы.Всерииразделенияпредварительныхсмеситестовыхэкспериментовбелковвоптимизированыусловияхусловиякапиллярнойэлектрохроматографии (КЭХ) на монолитной и PLOT-метакрилатной колонках.Варьироваликонцентрациюацетонитрила(0-50%)(Рисунок44)иконцентрацию рабочего буфера (10-100 мМ фосфорная кислота, рН 2,2) (Рисунок45).Оптимизированы условия электрофоретического разделения на монолитнойи PLOT-метакрилатной колонках:монолитная колонка: 30 мМ раствор фосфорной кислоты: ацетонитрил(4: 1, объемн.); электрокинетический ввод пробы: -10кВ, 5с;PLOT-метакрилатная колонка: 0,1 мМ раствор фосфорной кислоты:ацетонитрил (9: 1, объемн.); электрокинетический ввод пробы: 20кВ, 5с.
Рабочеенапряжение 20кВ. УФ-детектирование (214 нм).82Рис. 44. Зависимость скорости ЭОП от концентрации ацетонитрила.Рис. 45. Зависимость скорости ЭОП от концентрации фосфорной кислоты.На Рисунках 46, 47 представлены электрофореграммы смеси стандартовбелков в условиях КЭХ.Таким образом, положительный заряд на поверхности полимера при pH 2,2препятствует адсорбции белков, которые в этих условиях имеют тот же заряд.Возрастает эффективность и селективность разделения по сравнению с КЗЭ(таблица 2).Интенсивность сигнала8320,00200,001540,0010130,00050,00000200400600800Время миграции, сРис.46.Электрохроматограммасмесибелков(1мг/мл).Электрокинетический ввод пробы: -10кВ, 5с.
Монолитная капиллярнаяколонка: Lэфф/Lобщ= 8,5/45 см. УФ-детектирование: 214 нм. 1 – альбумин, 2– инсулин , 3 – миоглобин, 4 –лизоцим. Рабочий электролит: 30 мМ растворфосфорной кислоты: ацетонитрил (4: 1, объемн.).Рис. 47. Электрохроматограмма смеси стандартов белков (1мг/мл).Рабочий электролит: 0,1 мМ раствор фосфорной кислоты: ацетонитрил (9:1, объемн.). Электрокинетический вводпробы:20кВ, 5с.PLOT-метакрилатная капиллярная колонка: Lэфф/Lобщ= 8,5/45 см.
УФдетектирование: 214 нм. 1 – альбумин, 2 – инсулин , 3 – миоглобин, 4 –лизоцим.84Таблица 2. Сопоставление методов КЭХ (метакрилатный полимер) и КЗЭ,используемых для разделения белков.КонтролируемыйпараметрЭффективность (т.т./м)Фактор селективности(Rs Alb/Ins)Метакрилатный полимерКЗЭPLOTколонкиМонолитные колонки10000÷1500056 00025000÷350000,701,031,50÷2,10Однако сам процесс получения таких колонок длителен; возможно,образование пузырьков воздуха внутри капилляра приводящих к обрыву тока.Требовался поиск альтернативного катионного покрытия.85ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (ЭКХ)Отмечено,чтоиспользованиедендримеровисверхразветвленныхполимеров (СПР) в качестве стационарных и псевдостационарных фаз в КЭХ иЭКХ является весьма перспективным направлением [1].
Удобство применения ихв качестве компонентов хроматографических и электрофоретических системобусловлено следующими причинами:– дендримеры и сверхразветвленные полимеры (СРП) имеют большое числополярных терминальных групп, что обеспечивает им хорошую растворимость ивысокую термическую устойчивость;– различные модификации терминальных групп позволяют контролироватьих растворимость, реакционную способность и адгезию к поверхности, что, всвою очередь, позволит повысить селективность разделения;–внутримолекулярныеполости(гидрофильныеилигидрофобные)обеспечивают способность этим полимерам образовывать комплексы включениятипа «гость-хозяин» с аналитами различной природы;– в растворах макромолекулы СРП образуют стабильные и не зависящие отвнешней среды мицеллоподобные структуры.
Вязкость таких мицеллярныхрастворов невысокая в отличие от растворов поверхностно-активных веществ.Для создания альтернативных катионных покрытий испытаны новыеполимеры на основе сверхразветвленнного полиэтиленимина с различной массойядра 5 и 25 кДа и степенью модификации мальтозой. Наибольшее - в структуре А(90%), а наименьшее – в С (20%), что определяет и различие их погидрофильности и заряду (Рисунок 48).86H2NMalMalNNHNH2NNHH2NPEINH2NHNHN____NPEINHBH3*Py0.1M Na2B4O7MalOHNHNH2NСтруктура A(~90%)NMalPEIOHСтруктура B(~50%)NHMalNHNMal =HOHOOO HOOHOHOHNHHNNH2NNH2NH2HNPEINHHNNH2Структура C(~20%)NH2Рис.
48. Модификация сверхразветвленного полиэтиленимина мальтозой(Mal-PEI).Была выдвинута гипотеза: обсуждаемые полимеры могли бы сыграть рольпсевдостационарной, стационарной фазы и/или модификатора поверхностикварцевого капилляра, обеспечивая взаимодействие с аналитами с участием ядраи оболочки, тем самым, препятствуя сорбции белков и влияя на эффективность иселективность их разделения (Рисунки 49, 50).Рис.
49. Возможные взаимодействия белка с дендритным полимером.87Рис. 50. Реализация различных вариантов капиллярного электрофорезасиспользованиеммальтозилированногосверхразветвленныхполиэтиленимина.Выбор полиэтилениминного модифицированного дедримера обусловленналичием терминальных мальтозных групп и внутренних третичных и вторичныхаминогрупп, которые обеспечивают различный заряд сверхразветвленномуполимеру в зависимости от значения рН буферного раствора (Рисунок 51).Рис. 51. Зависимость заряда полимера от значения рН (концентрацияполимеров 0,5мг/мл) [89].88Степень взаимодействия полимера PEI-Mal с белками (альбумином) всущественной степени определяется размером полиэтилениминового ядра: чемоно меньше, тем слабее эти взаимодействия [90].Дляподтвержденияэтогообстоятельствапроведенасерияэлектрофоретических экспериментов с участием полимера PEI-Mal В (с массойядра 5 и 25 кДа) при рН рабочего буфера 8,5.
Установлено, что с уменьшениемразмера ядра взаимодействия молекул полимера с разделяемыми белкамиснижаются и проявляются лишь при больших концентрациях СРП (10 мг/мл).Поэтому для проведения дальнейших детальных исследований были взятыполимеры PEI-Mal 25кДа, имеющие большую массу.В аналогичных условиях при введении в состав буферного электролитаполимеров структуры А (с максимальной модификацией олигосахариднымифрагментами) различных генераций (А5 и А25) заметных различий в параметрахмиграции аналитов обнаружено не было (Рисунок 52).а)б)Рис. 52.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
