Диссертация (1150384), страница 14
Текст из файла (страница 14)
концентрированием пробы в процессе электрокинетического ввода пробы.7.1. Стэкинг с большим объемом образца (LVSS – large volume sample stacking).Изучены возможности стэкинга без переключения полярности (LVSS, largevolume sample stacking). При этом выполнялись условия: направление движениявсей массы раствора противоположно электрофоретическому движению ионов120аналитов,искоростьдвижениярабочегобуфераменьшескоростиэлектрофоретической миграции ионов аналита.Важным обстоятельством является то, что LVSS вариант концентрированияпозволяет вводить значительно больший объем образца, чем обычно.Так, большой объем образца, растворенного в слабопроводящей матрице (вводном растворе или разбавленном буфере), вводили в покрытый полимеромкапилляр, который предварительно заполнялся буферным электролитом с рН < 7.Поскольку определяемые белки в этих условиях имеют положительныйзаряд,онимигрируютккатодномуконцукапилляраподдействиемэлектрического поля, а противоположно направленный ЭОП выталкивает изкапилляраматрицу(Рисунок72).Этоспособствуетконцентрированиюположительно заряженных аналитов на границе водного и буферного растворов.Рис.
72. Схема стэкинга с большим объемом пробы без переключенияполярности.Достигнуты высокие степени концентрирования (таблица 13). Пределыобнаружения составили 2,5 мкг/мл.Выбор условий стэкинга проводился с учетом концентрации смеси белков ивлияния времени ввода на эффективность (Рисунок 73).121Рис. 73. Влияние времени ввода на эффективность.Аналиты: смесь стандартов белки (25 мкг/мл)Использование метода LVSS на PEI-Mal покрытых колонках привело к 50 79- кратному увеличению чувствительности и снижению пределов обнаружениядо 1.0-2.5 мкг/мл (таблица 13).
При этом следует отметить, что селективностьразделения альбумина и миоглобина значительно снизилась при увеличенииввода выше 300 с (Рисунки 74, 75).AU0.02520.0200.015410.01050.0053nm 1002003004005006007008009001000 1100 1200 1300 1400 1500секРис. 74. Электрофореграмма смеси белков (25 мкг/мл) на PLOTколонке с покрытием сверхразветвленным полимером PEI-Mal A25.Условия: -20кВ, -84-97мкА. Рабочий электролит: 0,1 М фосфатный буфер(рН 2,2);ввод пробы: 300 с×30 мбар.
УФ: 214 нм;1 – альбумин, 2 – лизоцим, 3 – миоглобин, 4 – инсулин;122Рис. 75. Влияние on-line концентрирования на интенсивностьаналитических сигналов белков.Разделение четырех основных белков (pH=2,2) с использованием колонкимодифицированной PEI-Mal A.а) без концентрирования, ввод 2 с; концентрация белков 1 мг/мл;б) LVSS, ввод: 300 с, концентрация белков: 25мкг/мл;с) LVSS с водной пробкой: ввод «водной пробки» (30 с); ввод образца 300 с;концентрация белков 10 мкг/мл;г) LVSS с водной пробкой и электрокинетическим вводом образца; ввод 90с×10 кВ, концентрация белков10 мкг/мл;порядок миграции белков: альбумин, лизоцим, миоглобин, инсулин.Условия: 77-93 мA; –20 kV; капилляр, 45.5 см × 50 мкм (внутреннийдиаметр) (эффективная длина, 38 см); рабочий буфер, 100 мM фосфатныйбуферный раствор, pH 2,2; детектирование при 214 нм.7.2.
Стэкинг с большим объемом образца с водной пробкойДля увеличения эффективности концентрирования был испытан стэкингLVSS с использованием «водной пробки». Наличие водной пробки, предварительновведенной на вход колонки, создает дополнительную зону низкой проводимости исильного электрического тока и облегчает миграцию и концентрированиезаряженных аналитов на границе раздела фаз. Такой процесс концентрированияпозволяет повысить чувствительность метода.123Для выбора оптимальных условий варьировали следующие параметры:время ввода «водной пробки» (10-30 с); время ввода анализируемой пробы (10 300 с).Оптимальными для данного варианта стэкинга оказались следующиеусловия: 30 с «водная пробка», 300 с гидродинамический ввод пробы (Рисунок76).Предел детектирования устанавливался экспериментально (соотношениесигнал/шум=3): для белков с использованием стэкинга LVSS с водной пробкой онсоставил 1–2 мкг/мл (таблица 13).
Использование гидродинамического вводанезначительно увеличило эффективность, что не позволило нам добитьсязначительного увеличения степени концентрирования.AU0.02520.0200.015410.01050.00530.000 nm3004005006007008009001000110012001300140015001600 секРис. 76. Электрофореграмма смеси белков (25 мкг/мл) на PLOT-колонке спокрытием сверхразветвленным полимером PEI-Mal A25.Ввод пробы: вода 30 с×30 мбар, проба 300 с×30 мбар.Остальные условия см. Рисунок 74.Наличие водной пробки непосредственно перед вводом образца в колонкутакже способствовало снижению пределов обнаружения до уровня 1.0-1.5 мкг/мл.1247.3.
Стэкинг с большим объемом образца с электростэкингомКонцентрирование пробы в процессе электрокинетического ввода пробыназывается электростэкингом. В этом варианте аналиты концентрируются награнице между низкопроводящей зоной и буферным электролитом: катионыконцентрируютсябезпереключенияполярности;длястэкингаанионовиспользуют отрицательную полярность.Важно отметить, что с использованием электростэкинга можно эффективносконцентрировать только катионные или анионные аналиты, и при этом вбольшей степени – ионы с высокой электрофоретической подвижностью.Достигаемые степени концентрирования оказались больше по сравнению созначениями, полученными при гидродинамическиом вводе пробы.Дляоптимизацииусловийстэкингаварьироваливремяэлектрокинетического ввода пробы (1-100 с), напряжение (10-20 кВ), составраствора пробы (разбавленный буфер, вода).Значительное снижение пределов обнаружениябыло достигнуто сприменением метода FESI-LVSS.
Так, пределы детектирования оказались вдиапазоне значений 100 - 500 нг/мл, что давало 340 – 1320-кратное увеличениечувствительности и обеспечивало возможность проведения количественногоанализа белков в биологических образцах (образцах мочи и крови человека).Требуемые результаты получены с использованием следующих условий:ввод пробы 90с, напряжение 15 кВ (Рисунок 77, приложение 3).125AU0.03020.025nm0.020310.0150.01040.0050123456789101112131415161718192021минРис. 77.
Электрофореграмма смеси белков (500 мкг/мл) на PLOT-колонке спокрытием сверхразветвленным полимером PEI-Mal A25.Ввод пробы: 2 с × 10кВ. Остальные условия см. Рисунок 74.Данный вариант стэкинга позволил уменьшить пределы обнаружения белков до100 нг/мл (таблица 13).Таблица 13. Результаты on-line концентрирования белков с использованиемPLOT- колонок; стационарная фаза - сверхразветвленные полимеры на основеполиэтиленимина с олигосахаридной оболочкой.Определяемые компонентыВариантконцентрированияАльбумин ЛизоцимМиоглобинИнсулинSEFS (SEFH)79 (110)Стэкинг с большимиобъемом вводимойпробы (LVSS)50(63)56 (76)68 (90)Условия: матрица пробы – вода,Гидродинамический ввод пробы (30 мбар, 300 с)ПО, мкг/мл2,01,02,02,5126SEFS (SEFH)81 (83)Стэкинг с большимобъемом вводимойпробы с «воднойпробкой»62 (63)60 (61)82 (93)Условия: матрица пробы – вода,Гидродинамический ввод воды (10 кВ, 25с),Гидродинамический ввод пробы (30 мбар, 300 с)ПО, мкг/мл1,01,01,51,0SEFS (SEFH)1320 (770)Электростэкинг с LVSS9701040(420)(570)340 (280)Условия: матрица пробы – вода,Электрокинетический ввод пробы (15 кВ, 90 с)ПО, мкг/мл0,2Болееэффективным0,1оказался0,2вариант0,5внутрикапиллярногоконцентрирования - стэкинг с электрокинетическим вводом пробы.Таким образом, сочетание стэкинга LVSS с электростэкингом позволилоопределять белки на уровне концентраций в реальных образцах (0,1 мкг/мл)(Рисунки 78, 81).7.4.
Анализ реальных объектовВ найденных условиях с использованием PLOT-колонок с дендримернымпокрытием (PEI-Mal) проведен анализ реальных объектов (сыворотка крови имочи).Пробоподготовка в случае сыворотки крови заключалась в фильтрациипробы через стекловолоконный и мембранный (инертный к белкам) микрофильтрс размерами пор 1-2 мкм и 0,2 мкм, соответственно.127Рис. 78. Электрофореграмма сыворотки крови (разбавлена в 10 раз) наPLOT-колонке с покрытием сверхразветвленным полимером PEI-Mal А25.
Вводпробы: 90 с×15 кВ.УФ: 214 нм. Условия анализа: -20кВ, -82-95мкА; рабочийэлектролит: 0,1 М фосфатный буфер (рН 2,2).При анализе белков в моче задача осложняется тем, что в ней присутствуютнизкомолекулярные компоненты самой разнообразной химической природы,включая пигменты, которые могут находиться в значительных концентрациях.Эти вещества поглощают при тех же длинах волн, что и белки (200-214 нм), влияяна их разделение, определение и воспроизводимость анализа. Поэтому передэлектрофоретическим разделением белков необходима предварительная очисткабиологического объекта (мочи): обессоливание и депигментация (Рисунок 35).Указанные процедуры проводили на самопроточной миниколонке с гелемтипа Sefadex G25 (с пределом исключения по белкам М=10000).Электрофореграмма экстракта мочи представлена на Рисунок 79.128Рис. 79.
Электрофореграмма обессоленной мочи (больной с синдромомИценко-Кушинга) на PLOT-колонке с покрытием сверхразветвленным полимеромPEI-Mal А25. Объем пробы 2,5 мл. Остальные условия см. Рисунок 78.1-альбумин.Получены сравнительные аналитические характеристики разделения белковвусловияхкапиллярнойэлектрохроматографиисиспользованиемсинтезированных PLOT-дендритных и PLOT-метакрилатных колонок, а также вусловиях капиллярного зонного электрофореза (таблица 14).В приложении 4 приведены соответствующие электрохроматограммы,полученные в условиях КЭХ и КЗЭ.Таким образом, лучшие результаты (таблица 15) по эффективности ивоспроизводимости параметров миграции для альбумина, лизоцима и миоглобинаотмечены в режиме капиллярной электрохроматографии с использованием PLOTколонок, модифицированных сверхразветвленными полимерами, для которыххарактерна и более простая процедура синтеза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
