Диссертация (1150384), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Ввод пробы – гидродинамический(давлением); 0,05 атм. Воздушное термостатирование капилляра проводилосьпри+20°С.ВкачествемаркераЭОПаиспользовался3%-ыйраствордиметилсульфоксида в соответствующем рабочем электролите.2.4.5. Эллипсометрический анализПолучение тонкой полимерной пленки PEI-Mal A25Кремниевую пластину помещали в раствор этанола в ультразвуковую ванну(2×10мин), промывали деионизированной водой. Затем проводили травлениеповерхности для обеспечения максимального количества гидроксильных групп.Далее кремниевую пластину помещали в смесь, содержащую водный раствораммиака (конц.), 30%-ый раствор H2O2 и H2Oдеиониз в соотношении (1:1:1,объемн.)на 30 мин при 65°C, а затем пластину тщательно промывали деионизированнойводой и высушивали в токе азота.ДалееготовилирастворполимераPEI-MalA25:водныйрастворполиэтиленимина (1.5%; масс.), модифицированного мальтозой с массой ядра25кДа (PEI-Mal A25) и содержащий 25 мг лимонной кислоты на каждые 100 мг.69Раствор полимера PEI-Mal A25 фильтровали через нейлоновый фильтр сразмером пор 0,2мкм.Получение тонкой полимерной пленки PEI-Mal A 25.Раствор полимера PEI-Mal A25 наносился на кремниевую пластину спомощью спин-коутера при скорости вращения 3000 об/мин в течение 15 с.Пластинка помещалась в вакуумную печь при 170 °C на 2 ч.
Затем ее охлаждалина воздухе до комнатной температуры и промывали деионизированной водой втечение 2ч и высушивали в токе азота.Условия эллипсометрического определения адсорбции белковОпределение толщины полимерной пленки PEI-Mal A25 (d) и показателяпреломления (n) в сухом и набухшем состоянии осуществляли с помощьюмноговолнового эллипсометра в спектральном диапазоне 380-900 нм и угломпадения 70°[69]. Все значения показателей преломления даны для λ=632.8нм.Оптическая модель для оценки оптических параметров (эффективнойтолщины и показателя преломления) полимерной пленки и белкового слояпредставлена на Рисунке 36.Рис. 36.
Модель оптического слоя, использованная при полученииэллипсометрических данных.70Масса адсорбированного белка (m, мг/м2) устанавливалось в соответствии суравнением (25) [75]:m(25)где dpl,эфф – эффективная толщина слоя адсорбированного белка (нм); npl–показатель преломления слоя белка; nam – показатель преломления внешней среды(буфер) и (dn/dc)pl– инкремент показателя преломления белков: 0,187 см3/г дляальбумина; 0,188 см3/г для лизоцима; 0,185 см3/г для миоглобина и инсулина [87].2.5. Приготовление рабочих растворов2.5.1.Приготовление буферных растворовПриготовление 1М фосфатного буферного раствора (pH=2,2)В 40 мл дистиллированной воды растворяли 6,8 г дигидрофосфата натрия(NaH2PO4·2H2O) и 0,25 мл 85%-ного раствора фосфорной кислоты. Объем буферадоводили дистиллированной водой до 50 мл.Молярность буфера по фосфат-ионам составила 1 М. Готовый буферфильтровали через бумажный фильтр, дегазировали на ультразвуковой бане ипомещали в чистую стеклянную емкость объемом 50 мл, которую герметическизакрывали.Подготовка боратного буферного раствора для КЭ и эллипсометрииВ 800 мл дистиллированной воды растворяли 1,85 г борной кислоты, пооткалиброванному pH-метру доводили pH до 10,5 добавлением 2М раствораNaOH.
Затем объем буфера доводили дистиллированной водой до 1000 мл идостигали требуемого значения pH тем же раствором щелочи. Буфер имелмолярность по борной кислоте 0,15 М. Готовый буфер фильтровали через71бумажный фильтр, помещали в чистую стеклянную емкость объемом 1000 мл,дегазировали на ультразвуковой бане и хранили в холодильнике при температуре+4°С. Буферные растворыменьшеймолярностиполучалиразбавлениемисходного раствора.Для приготовления раствора каждого из дендритных полимеров сконцентрацией (0,5; 1; 2; 4; 8) мг/мл на микроаналитических весах брали точнуюнавеску, помещали в сухие чистые эппендорфы и приливали 1 мл рабочегобуферного электролита.2.5.4.
Приготовление стандартных растворов белковДля приготовления стандартного раствора каждого из белков (альбумин,лизоцим, миоглобин, инсулин) с концентрацией 1 мг/мл на микроаналитическихвесах брали точную навеску (1 мг), помещали в сухие чистые эппендорфы иприливали 1 мл дистиллированной воды.
Флаконы с полученными растворамиснабжали этикетками с указанием концентрации и хранили в холодильнике доанализа при температуре -10°С. Рабочие растворы с меньшими концентрациямиполучали количественным разбавлением стандартного раствора с помощьюавтоматического дозатора.2.6. Обработка полученных данных2.6.1. Определение эффективности в капиллярном зонном электрофорезе(КЗЭ) и капиллярной электрохроматографии (КЭХ)Эффективностькапилляраимонолитнойколонкиопределяласьэкспериментально из электрофореграмм по формуле (26):N = 5,545 * (tR/wh) 2,где N - эффективность хроматографической колонки, т.т./м;tR – время удерживания, с;wh – ширина пика на полувысоте, с.(26)722.6.2.
Оценка пористости монолитного сорбентаФотографии среза поверхности монолитного капилляра получали наконфокальном лазерном сканирующем микроскопе (LeicaTCSSL) при λвозб= 488нм. Для каждой колонки получали как минимум 30 фотографий (приложение 1).Обработка фотографий производилась в пакете прикладных программ длярешения задач технических вычислений MATLAB 7.5 с использованиемприложения Image Processing Toolbox.Алгоритм вычисления пористости сорбента следующий:1.Создание бинарного изображения.2.Определение числа объектов.3.Построение гистограммы распределения по площадям.Скрипт для определения числа объектов и построения гистограммыприведен ниже:clear, close allI = imread('monolith.jpg');BW = imextendedmin(I,20);figure,imshow(BW)[labeled,numObjects] = bwlabel(BW,4);graindata = regionprops(labeled,'basic')x = 0:2:70;hist([graindata.Area],x)axis([0 70 0 250]);print -djpeg h-monolith.jpgN=hist([graindata.Area],x);xlswrite('1', N,'List1', 'B2')732.6.3.
Оценка воспроизводимости процедуры синтеза монолитныхкапиллярных колонокИз графических зависимостей распределения пор по площади, полученныхв п.2.6.2., высчитывали процентное содержание макро- и микропор в структуремонолита для каждой колонки. Затем рассчитывали среднеквадратичноеотклонение содержания для макро- и микропор в колонках по уравнению (27, 28):(27)где– среднее значение содержания пор;xi – содержание пор в i-ой колонке;n – количество монолитных колонок.(28)74ГЛАВА 3. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ НА МОНОЛИТНЫХ И PLOTМЕТАКРИЛАТНЫХ КОЛОНКАХ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙЭЛЕКТРОХРОМАТОГРАФИИКапиллярная электрохроматография (КЭХ) – активно развивающийсягибридный метод разделения.
Его специфика в отличие от ВЭЖХ состоит в том,что гидродинамический поток подвижной фазы заменяется электроосмотическим(ЭОП), формирующимся в капиллярной колонке при наложении внешнегоэлектрическогополя.Плоскийпрофильпотокаобъясняетибольшуюэффективность в КЭХ по сравнению с ВЭЖХ (Рисунки 2, 4). В настоящее времяэтот метод активно востребован в протеомике при определении пептидов ибелков.Электрофоретические методы в последние годы привлекают все большеевнимание химиков-аналитиков при решении различных медико-биологическихзадач благодаря их высокой эффективности, экспрессности, низкой стоимости ипростоте оборудования.При этом возникает ряд проблем, одна из которых - необратимая адсорбциябелков и пептидов на внутренней поверхности кварцевого капилляра вследствиеэлектростатическогоаналитовсвзаимодействиязаряженнымизаряженныхгруппамисорбента.функциональныхВсеэтогруппприводиткневоспроизводимости параметров миграции и снижению чувствительности из-занестабильности базовой линии.Возможными решениями являются: использованиединамическогоиликовалентногопокрытиявкапиллярном зонном электрофорезе (КЗЭ); введение в состав буферного электролита псевдостационарной фазы –электрокинетическая хроматография (ЭКХ);75 созданиетонкогопористогослояполимеранавнутреннейповерхности кварцевого капилляра – создание т.н.
PLOT-колонок вКЭХ; заполнение капилляра пористым монолитным сорбентом (КЭХ).Все эти варианты реализованы в данной работе.Перспективнымипсевдостационарныхматериаламифазвусловияхвкачествекапиллярнойстационарныхиэлектрохроматографииявляются метакрилатные и дендритные полимеры типа «ядро-оболочка» (Рисунок37).
Первые уже зарекомендовали себя при определении пептидов и белков [88].Наличие у последних большого числа терминальных функциональных групппозволяет регулировать их растворимость и термическую стабильность, амицеллоподобная структура с низкой вязкостью мицеллярных растворов –формировать псевдостационарные фазы.ПолиметакрилатныеСверхразветвленные полимерытипа «ядро-оболочка»Рис.37.Перспективныематериалывпсевдостационарных фаз в условиях ЭКХ и КЭХ.качествестационарныхи76Решение другой проблемы электрофоретического определения белков –высокие пределы обнаружения – мы видим в поиске соответствующего способаon-line концентрирования.Таким образом, цель работы: оценить аналитические возможностидендритных полимеров типа «ядро-оболочка» на основе полиэтиленимина смальтозной оболочкой в качестве стационарных и псевдостационарных фаз вкапиллярном электрофорезе ипредложить варианты внутрикапиллярногоконцентрирования для определения белков в биологических жидкостях.В качестве тестовой смеси выбраны белки: миоглобин, инсулин, лизоцим иальбумин – диагностические маркеры многих заболеваний, различающиесяизоэлектрическими точками и молекулярными массами, что принципиально привыявлении работоспособности подготовленных колонок для КЭХ и ЭКХ (таблица1).Таблица 1.
Исследуемые белкиБелокИзоэлектрическаяточка, pIMr,г/мольМиоглобин7.017800Инсулин5.55808Лизоцим11.014300Альбумин4.766241Тип заболеванияИнфаркт миокардаТравмы ожогиСудорогиСахарный диабетДиагностикавнутрибрюшных абсцессовОценка степени рискаразвития гнойнойинфекции.Микроальбуминурия3.1. Синтез полиметакрилатного полимера in situНами синтезированы полиметакрилатные монолитные и PLOT-колонки наоснове глицидилметакрилата, метилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата.773.1.1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
