Диссертация (1150288), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Валидационные характеристики разработанных методикПараметрСелективностьLLOQКалибровочный диапазонLLOQПовторяемостьВерхнийуровень QCLLOQПравильностьВерхнийуровень QCСтепень извлечения, (n=5)Матричный эффектЦисплатинСилденафилЦиклосеринРопиниролКапецитабин5-фторурацил100%100%100%100%100%100%Допустимоезначениепараметра>90%10 нг/мл1 нг/мл0,3 мкг/мл10 пг/мл20 нг/мл20 нг/мл-10-400 нг/мл1-1000 нг/мл0,3-30 мкг/мл10 – 2000 пг/мл20-4000 нг/мл20-800 нг/мл-151,23,35,15,78,6<20%3,76,71,25,01,57,6<15%9889,395,3102,5100,398,680-120%104,994,996,8104,3103,998,685-115%92±395±477±289±560±847±4-5,24,00,84,413,28,4<15%82На рис. 31-35 приведены градуировочные зависимости, характеризующиелинейный диапазон каждой из разработанных биоаналитических методик.14000000001200000000y = 3E+06x + 6E+06R2 = 0,9984Площадь10000000008000000006000000004000000002000000000050100150200250300350Концентрация, нг/млРис.31.
Градуировочная зависимость для цисплатина.y = 0.008x + 0.00232r = 0.9984Весовой коэффициент 1/х2Рис.32. Градуировочная зависимость для силденафила40045083y = 0.95x + 0.00327r = 0.9992Весовой коэффициент 1/уРис.33. Градуировочная зависимость для циклосеринаy = 0,0024 x + 0,0616r = 0,9981Весовой коэффициент 1/х2Рис.34.
Градуировочная зависимость для ропинирола84(а)y = 0,000345 x + 0,00116r = 0,9981Весовой коэффициент 1/х2(б)y = 0,00208 x + 0,0206r = 0,9907Весовой коэффициент 1/х2Рис.35. Градуировочная зависимость для капецитабина (а) и 5-фторурацила(б)Проведенаоценкастабильностианалитоввразличныхусловиях:стабильность замораживания и размораживания, краткосрочная и долгосрочнаятемпературная стабильность в плазме крови, стабильность образцов послепробоподготовки в автодозаторе.В соответствии с установленными требованиями проведены исследованиястабильности каждого из рассматриваемых аналитов.Результаты представлены в табл. 11.85Таблица 11.
Оценка стабильности аналитов при различныхусловиях хранения (указано отклонение в % от номинальнойконцентрации)УсловияЗамораживаниеразмораживание(3 цикла)КраткосрочнаястабильностьДолгосрочнаястабильностьСтабильность вавтодозатореЦисплатинСилденафилЦиклосеринРопинирол8,4%11,3%7,1%13,8%10,0%8,5%8,9%(18 ч)12,0%(3 мес.)0,7%(18 ч)8,8%(24 ч)7,8%(3 мес.)6,7%(24 ч)4,7%(24 ч)2,9%(3 мес.)10,8%(24 ч)11,6%(8 ч)10,7%(1 мес.)12,7%(8 ч)7,5%7,1%(18 ч)(14 ч)8,2%13,1%(1 мес.) (1 мес.)5,8%3,3%(18 ч)(15 ч)Капецита 5-фторурбинацилII.9.
Клинические исследования, выполненные с применениемразработанных методикРазработанная методика определения цисплатина в плазме крови былаприменена при проведении исследования общей токсичности при изолированнойперфузии легкого (содержание 250 мг). Концентрацию цисплатина определяличерез 0; 5; 15; 30; 60; 80; 120 мин после проведения перфузии. Всегопроанализировано 70 образцов плазмы крови.Методика определения силденафила в плазме крови применена дважды припроведениидвухисследованийсравнительнойфармакокинетикиибиоэквивалентности силденафила (100 мг) и препарата сравнения у здоровыхдобровольцев. В каждом исследовании принимали участие 30 пациентов.
Заборыкрови осуществлялись исходно (до приема препарата) и через 2, 4, 8, 12, 24, 26,28, 30, 32, 34, 36, 48, 96, 168, 336, 504, 672 часа после приема препарата. В каждомиз двух исследований по определению силденафила проанализировано 1080образцов плазмы крови.Методика определения циклосерина в плазме крови применена припроведении двух открытых рандомизированных перекрестных исследованийсравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности циклосерина и препарата86сравнения (капсулы 250 мг) при пероральном приеме здоровыми взрослымидобровольцами. В каждом исследовании принимали участие 23 пациента. Заборкрови осуществлялся до приема препарата и через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 24,36, 52 часа после приема. В каждом из двух исследований по определениюциклосерина проанализировано 644 образца плазмы крови.Разработаннаяпроведенииметодикаоткрытогоопределенияропинироларандомизированногопримененаперекрестногоприисследованиясравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности ропинирола и препаратасравнения (2 мг).
В исследовании принимало участие 24 человека. Забор кровиосуществлялся до приема препарата и через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 18, 24, 36, 48 часов после его приема. Всего проанализировано 912 образцовплазмы крови.Методикасовместногоопределениякапецитабинаи5-фторурацилаприменена при проведении открытого рандомизированного перекрестногоисследованиясравнительнойфармакокинетикиибиоэквивалентностикапецитабина и препарата сравнения (200 мг). В исследовании принимала участиегруппа из 24 человек. Забор крови осуществлялся исходно (до приема) и через 0,0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 часов после приема препарата. Всего врамках исследования проанализировано 1536 образцов плазмы крови.Все описанные исследования проводились в биоаналитическом центре«ЦКП «Аналитическая Спектрометрия».87ГЛАВА III.
ВЫЯВЛЕНИЕ И УСТРАНЕНИЕ МАТРИЧНЫХЭФФЕКТОВ, ПРИВОДЯЩИХ К НЕУДОВЛЕТВОРИТЕЛЬНОЙСХОДИМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗАIII.1. Матричный эффект при определении цисплатина в плазмекровиДляопределенияхроматографическихицисплатинаопробованымасс-спектрометрическихразличныеусловий,вариантывключающиеварьирование элюирующих систем (природа органического растворителя,процент его содержания, добавка кислоты), диапазона регистрируемых масс,концентраций аналита в пробе (табл.12).Таблица 12. Опробованныеопределении цисплатинаКолонка:Элюирующие системы:Регистрируемые сигналыm/z:Диапазон концентраций:СогласнохроматографическиеусловияприREPROSYL-PUR C18-AQ, 150x2 мм, 3мкм10, 60, 80% CH3OH+0,01% H3CCOOH;CH3OH:CH3CN:H2O (50:30:20)+0,1% HCOOH;80% CH3CN+0,1% HCOOHScan: 190-450, 280-350, 295-325, 250-325SIM: 266, 284, 301, 3230.25 – 2.5 мкг/мллитературнымданным[125-127]ВЭЖХ-МСопределениецисплатина чаще всего проводится в виде комплексов платины с различнымиагентами.В качестве комплексообразующего агента на основании [125] былопробован глутатион в восстановленной форме.
Реакцию проводили последующей схеме: Смешивали эквимолярные количества глутатиона и цисплатина (300 мклраствора цисплатина, 1 мкг/мл и 276 мкл раствора глутатиона, 1 мкг/мл)88 Инкубировали при 37ºС в течение 1 ч Проводили жидкостно-жидкостную экстракцию. В качестве экстрагентаиспользовали 2 мл хлороформа. Органический слой, выпаривали досуха иостаток перерастворяли в 300 мкл CH3CN.Массы ожидаемых аддуктов цисплатина с глутатионом m/z 570 и 835(рис.36).ClH3NPtOSH2CNH3HCHNCCOCH2NHm/z 570CH2CH2HCCOOHNH2m/z 835COOHРис.36. Структуры возможных аддуктов цисплатина и глутатиона [128].При масс-спектрометрическом анализе не был обнаружен ни один изожидаемых сигналов m/z. По этой причине от такого комплексообразующегоагента пришлось отказаться.Другой подход – взаимодействие цисплатина с диэтилдитиокарбаматом(ДДТК, DDTC) натрия с образованием соответствующего двухлигандногокомплекса (рис.
37) (раствор цисплатина и 10% ДДТК в 0,1 M р-ре NaOH всоотношении 10:1 (объемн.) и инкубирование при 37 ºС в течение 30 мин)[126].NH3ClClS+ 2PtNH3SCN-SРис.37.Образованиедиэтилдитиокарбамата.-2NH3-2ClдвухлигандногоNSPtCSCNSкомплексаплатиныиДля определения цисплатина в такой аналитической форме использоваликолонку REPROSYL-PUR C18-AQ. Выявлено влияние на хроматографические и89масс-спектрометрические характеристики пика аналита содержания ацетонитрилав составе подвижной фазы (75 – 85%), муравьиной и уксусной кислот (0,01 –0,5%), ацетата аммония (2 – 15 мМ) и аммонийно-ацетатного буфера сразличными значениями рН (3, 4, 5).Для выбора параметров ионизации при определении цисплатина в видедвухлигандного комплекса с диэтилдитиокарбаматом варьировали значениефрагментора (50 – 200 В), напряжение на капилляре (500 – 4000 В), давлениераспыляющего газа азота (20 – 60 psig), скорость потока осушающего газа(7 - 11 л/мин), температуру осушающего газа (200 – 350 ºС).
Выбирали тезначенияпараметров,хроматографическогоприпикакоторыханалитаплощадьбылаиинтенсивностьмаксимальна.Определениедвухлигандного комплекса платины и ДДТК осуществляли по сигналу m/z 491.После выбора условий хромато-масс-спектрометрического определенияциклосерина необходимо было разработать процедуру пробоподготовки плазмыкрови для извлечения комплекса платины и диэтилдитиокарбамата.Первоначально для этой цели были выявлены возможности жидкостножидкостнойэкстракциисиспользованиемразличныхорганическихрастворителей (хлороформ, гексан, гептан, этилацетат).
Установлено, что дляизвлечения комплекса из реакционной смеси, общий объем которой составлял 550мл, требуется 1 мл хлороформа (использование для этой цели другихрастворителей оказалось малоэффективным).На границе водного и органического слоев наблюдалось образование ещеодного слоя – белкового, который мешал отделению органического растворителя(нижний слой). Для эффективного разделения фаз опробована процедуразамораживания при -25ºС. Однако при анализе подготовленных таким образомпроб, выяснилось, что после замораживания площадь хроматографического пика,соответствующего комплексу Pt(DDTC)2, значительно меньше, чем в случаеэкстракциибеззамораживания.Поэтомубылорешеноотказатьсяиспользования такого способа разделения водного и органического слоев.от90В связи с этим в процедуру пробоподготовки перед ЖЖЭ была введенастадия осаждения белков ацетонитрилом.Степень извлечения при ЖЖЭ из плазмы крови составила 66±5 %.Для увеличения степени извлечения образующегося комплекса из плазмыкрови было принято решение применить сорбционное концентрирование вкачестве процедуры пробоподготовки.Как и в случае ЖЖЭ, после образования комплекса проводили осаждениебелков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
