Диссертация (1150288), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Достигнутый пределопределения при конечном варианте пробоподготовки составил 10 нг/мл (Рис. 46)[130].MSD1 TIC, MS File (P2414544.D)API-ES, Pos, SIM, Frag: 10046A4.567rea:36CYC20000042250017500150001250010000750050002500123456minРис.46. Хроматограмма образца плазмы крови с добавкойцисплатина - CYC (10 нг/мл) после дериватизации и пробоподготовки.Условия анализа (см.
рис.44).Для оценки матричного эффекта при определении цисплатина в форметрехлигандного комплекса подготовлено 12 образцов плазмы крови различныхдоноров с добавкой цисплатина. Для каждого образца проведена оценкаматричного фактора и вычислено среднее его значение для всех образцов.Сопоставление коэффициентов вариации для двух- и трехлигандного комплексаплатины и ДДТК показало, что втором случае влияние биологической матрицы наопределение аналита не проявляется (табл.15).101Таблица 15. Сопоставлениеаналитических форм цисплатинаматричныхфакторовдлядвухАналитическая формаMF (среднее)n=12Коэффициентвариации, %Pt(DDTC)2Pt(DDTC)3+0.67±0.230.93±0.05345Такимобразом,врезультатепримененияописанногоподходаусовершенствования процедуры дериватизации описанный выше матричныйэффект устранен.
Это независимо подтверждено проверкой на образцах плазмыкрови 12-ти различных доноров. Коэффициент вариации снизился с 34% длядвухлигандного комплекса до 5% в случае комплекса трехлигандного.Параметры разработанной методики валидированы согласно установленныммеждународным критериям EMA.III.2. Матричное влияние при определении силденафила в плазмекровиПодобного типа проблема продемонстрирована и на примере ВЭЖХ-МС/МСопределения препарата силденафила (рис.47) при использовании сорбционногоконцентрирования в качестве процедуры пробоподготовки. Однако в данномслучае прием для устранения мешающего эффекта матрицы принципиальноотличался.102Структура силденафила (pKa 8.7)Структура тразодона (pKa 6.7)Рис.47.
Строение силденафила и тразодона (внутренний стандарт).При разработке процедуры извлечения силденафила из плазмы кровиопробованы различные типы сорбентов (гидрофобный Sep-Pak®Vac tC18,катионообменный Oasis MCX, смешанного типа гидрофильно-липофильный OasisHLB); варьировались условия промывки сорбента и элюирования аналита.Подобраныразличныеусловияпроведенияпроцедурысорбционногоконцентрирования (табл. 16) с высокими степенями извлечения силденафила (90 –100%), но различной чистотой конечного экстракта (рис.
48). Экстракт плазмыкрови после извлечения катионнообменным сорбентом MCX содержит большоеколичество эндогенных компонентов, которым соответствует на хроматограммеширокий интенсивный пик (1–2 мин) (рис. 48). При серийных анализах это можетприводить к изменению хроматографических характеристик колонки и снижениюобщего срока её службы, поэтому методика становится малоприменимой дляклинических исследований. Пробы, полученные из плазмы крови, с применениемсорбентов HLB и Sep-Pak®Vac tC18, оказались значительно чище, однако впервом случае имеются интерференции в интересующем временном диапазоне(рис.
48).Предпочтение было отдано сорбенту Sep-Pak®Vac tC18, при которомселективность извлечения максимальна, а получаемый экстракт содержитминимальное количество матричных компонентов. Показано, что использованиепоследовательной промывки сорбента водой и 30%-ным раствором метанолапозволяет практически полностью избавиться от мешающих компонентов103матрицы (рис. 39), а элюирование 100%-ным метанолом обеспечивает полноеизвлечение аналита с сорбента. Степень извлечения здесь и в дальнейшемвычисляли по формуле:RS1S2,(5)где R – степень извлечения, S1 – площадь пика в пробе с добавкой аналита до пробоподготовки,S1 – площадь пика в пробе с добавкой аналита после пробоподготовки.123t, минРис.
48. Хроматограммы экстрактов плазмы крови после извлеченияи очистки на сорбентах Oasis HLB – гидрофильно-липофильный (1), OasisMCX – катионообменный (2) и Sep-Pak®Vac tC18 – гидрофобный (3)(увеличен диапазон времени удерживания силденафила S).Условия хроматографирования: жидкостный хроматограф Agilent с УФдетектором, колонка Agilent Eclipse Plus C18, п. ф. 40 об. % CH3CN - 60 об.
% 40 мМацетатно-аммонийного буферного раствора (рН 7), скорость потока 300 мкл/мин, длинаволны детектора 290 нм.Среднее значение степени извлечения силденафила в данных условияхсоставило 95±4 % (n = 10), а тразодона 93±4 % (n = 10) [131].104Таблица 16. Степень извлечения силденафила из плазмы крови сиспользованием различных типов сорбентовТип сорбентаУсловия сорбционного концентрированияСтепеньизвлечениясилденафила, %(n=10)1.
Кондиционирование сорбента:1 мл CH3OH, 1 мл H2OOasis HLB2. Загрузка образца (Плазма крови, рН 10,0)(гидрофильно3. Промывка сорбента:липофильный1 мл 5 % CH3OH, 2 % NH4OHбаланс)1 мл 20 % CH3OH, 2 % NH4OH4. Элюирование 1 мл CH3OH5. Выпаривание и перерастворение в п.ф.1. Кондиционирование сорбента:1 мл CH3OH, 1 мл H2O2. Загрузка образца (Плазма крови, рН 10,0)Sep-Pak®Vac tC183. Промывка сорбента:(гидрофобные1 мл H2Oвзаимодействия)1 мл 30 % CH3OH4. Элюирование 1 мл CH3OH5. Выпаривание и перерастворение в п.ф.1. Кондиционирование сорбента:1 мл CH3OH, 1 мл H2O2.
Загрузка образца (Плазма крови, рН 4,0)Oasis MCX3. Промывка сорбента:(катионообменные1 мл 0,1 н HClвзаимодействия)1 мл CH3OH1 мл 20 % CH3OH, 2 % NH4OH4. Элюирование 1 мл CH3OH, 5 % NH4OH5. Выпаривание и перерастворение в п.ф.90 ± 695 ± 498 ± 6В методе ВЭЖХ-МС/МС с электроспрей ионизацией подвижная фазадолжнасодержатьионизационныхлетучиехарактеристиккомпоненты,аналита.способствующиеПоэтомуулучшениюиспользоваливодно-метанольные и водно-ацетонитрильные системы с добавками муравьинойкислоты и формиата аммония. Лучшей оказалась подвижная фаза составаацетонитрил вода (40 : 60 по объему) с добавкой 5 мМ раствора формиатааммония (pH 6,5). Время удерживания силденафила в этих условиях составило 5,0мин, а тразодона – 3,9 мин.
Тразодон в качестве внутреннего стандарта выбран наосновании наличия схожих структурных фрагментов в его молекуле и, какследствие, близких ионизационных характеристик и сорбционных свойств.105Определение силденафила и тразодона осуществляли по MRM-переходамm/z 475→282 и m/z 372→147, соответственно. Однако при оценке матричныхфакторов для образцов плазмы крови 6 различных доноров выяснилось, чтокоэффициент вариации превысил 40%. Кроме того, среднее значение матричногофактора для всех образцов составило 1,34±0,62, что указывает на усилениеаналитического сигнала.Первоначально было высказано предположение о совместной ионизациимолекул аналита и неизвестных компонентов биологической матрицы, которыеусиливаютвеличинуаналитическогосигнала.Попыткиизменитьхроматографические условия определения аналита с целью изменения времениего удерживания и отделения от нерегистрируемых матричных компонентов непривело к положительному результату – коэффициент вариации матричныхфакторов для 12 образцов плазмы крови различных доноров не удовлетворялустановленным критериям [1].БылапредпринятапопыткаопределятьсилденафилподругомуMRM-переходу: m/z 475→58.
И в этом случае рассчитанные значения матричныхфакторов характеризовались удовлетворительным значением коэффициентавариации – 4% при среднем значении матричного фактора 0,89±0,04. Такие несовсем ожидаемые результаты заставили задуматься о природе происхожденияданного эффекта.Поскольку для каждого из MRM-переходов родительский ион один и тотже, говорить о вовлечении компонентов матрицы в процессы ионизации как опричине матричного эффекта для одного из переходов нельзя.
Если матричныекомпоненты влияли бы на ионизацию, это должно было бы проявиться в равнойстепени для обоих MRM-переходов.Вероятно, процесс влияния биологической матрицы в данном случае болеесложен. После прохождения через первый квадруполь ионы силденафила инеизвестных матричных компонентов с тем же значением m/z подвергаютсяфрагментации в ячейке соударений – втором квадруполе. Предположительновлияние матричных компонентов проявляется именно на данном этапе, т. е. в106случае перехода m/z 475→282 матричные компоненты имеют схожую смолекулой силденафила картину фрагментации и вносят вклад аналитическийсигнал аналита. В то же время другой путь фрагментации – m/z 475→58 – дляматричных компонентов не характерен, и поэтому в конечном итоге влияниематрицы не наблюдается.На рис.
49 представлены масс-спектры в режиме сканирования первымквадруполем (А), а также спектры, получаемые после фрагментации для каждогоиз упомянутых MRM-переходов (Б, В). Кроме того, показан основной путьфрагментации в молекуле для каждого из обсуждаемых МRМ-переходов.Обнаружение подобного матричного эффекта еще раз доказывает, чтоиспользование даже такой мощной аналитической техники, как тандемная массспектрометрия, не гарантирует отсутствия проблем, связанных с мешающимвлиянием матричных компонентов при определении лекарственных препаратов вбиообъектах.107I, отн.ед.m/z 475А+[M+H]m/z, Даm/z 475 → 282I, отн.ед.m/z 475 → 58Бm/z 282Фрагмент дляколичественногоопределенияm/z, ДаI, отн.ед.Фрагмент дляколичественногоопределенияm/z 58Вm/z, ДаРис.
49. Масс-спектр силденафила в режиме scan 470-480 m/z (А); МС/МС-спектр силденафила (scan 50-60 m/z) (Б);МС/МС-спектр силденафила (scan 280-290 m/z) (В).108III.3. Матричные эффекты при определении капецитабина и5-фторурацила в плазме кровиРазработка методики одновременного определения противоопухолевогопрепарата капецитабина (рис. 50) и его основного метаболита 5-фторурацилапредставляло наибольшие трудности с точки зрения матричного влияния, котороепроявлялось как в подавлении ионизации, так и в плохой воспроизводимостизначений матричных факторов для образцов плазмы крови различных доноров.(1)(2)(3)(4)Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
