Диссертация (1150288), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Использование пропанола-2 вкачестве добавки в подвижную фазу позволило сократить время удерживания (4.4мин для циклосерина и 4.9 мин для внутреннего стандарта), однако, форма пикабыла неудовлетворительной. Использование подвижной фазы с наилучшимнайденным соотношением метанола и пропанола-2 и с pH 2,5, доведенным доэтого значения трифторуксусной кислотой, позволило добиться приемлемойформыпикааналита,сохранивприэтомвремяудерживания.Хроматографические условия представлены в табл.
20.Таблица 20. Хроматографические условия определения циклосеринаКолонкаПодвижная фазаСкорость потокаОбъем пробыYMC-Pack SIL-06, 150×4.6 mm; 3µmметанол/пропанол-2/0.15% трифторуксусная кислота,67:28:5 (объемн.)0.5 мл/мин10 мкл118При оценке матричного эффекта проведен анализ 12 образцов плазмы кровиразличных доноров. Значения коэффициента вариации не превысили 0,8%, чтоговорит об отсутствии влияния матрицы на определение циклосерина.Однако, несмотря на достигнутое, при построении градуировочнойзависимости с использованием образцов плазмы крови наблюдался эффектнарушения линейности на верхних концентрационных уровнях (рис.56).
Данныйэффект обнаружен исключительно для образцов плазмы крови, в то время как дляводных стандартных растворов линейность градуировочной зависимости ненарушалась. Это могло быть вызвано конкурентными процессами при ионизациимежду молекулами аналита и матричными компонентами. Данный эффект былустранен путем уменьшения объема вводимой пробы до 1 мкл, что позволиловносить меньшее количество матричных компонентов в ионный источник, темсамым положительно влияя на ионизацию молекул самого циклосерина (рис.57).y = 0,4542 x + 0,213y = 1,0081 x + 0,072R2 = 0,9651R2 = 0,9988Рис.56.Градуировочнаязависимостьприпроявлении«эффекта нарушения линейности» приопределении циклосерина в плазмекрови.Рис.57.Градуировочнаязависимостьпослеустранения«эффекта нарушения линейности»при определении циклосерина вплазме крови.119IV.2.
Матричное влияние при определении ропинирола в плазмекровиПроблема нарушения линейности, описанная в предыдущем случае,обнаружиласьиприопределениипротивопаркинсоническогопрепаратаропинирола в плазме крови (рис.58).Структура ропиниролаСтруктура циталопрамаРис. 58. Строение ропинирола и циталопрама (внутренний стандарт).На рис. 59 сплошной линией обозначена линия тренда, вычисленная пометоду наименьших квадратов.
Пунктирная линия соединяет экспериментальныеградуировочные точки. Как видно, при увеличении концентрации ропиниролалинейность градуировочной зависимости нарушается. Однако, решение этойпроблемы подобно предыдущему случаю оказалось неприемлемым ввиду крайненизкого требуемого предела определения ропинирола (10 пг/мл). В итоге, былорешено отказаться от разработанной первоначально процедуры жидкостножидкостнойэкстракциивметил-трет-бутиловыйэфирдляизвлеченияропинирола из плазмы крови в пользу сорбционного концентрирования.Предпосылками к этому решению служило предположение о том, чтосорбционноеконцентрированиепозволяетполучатьэкстракты,наименееобремененные присутствием матричных компонентов по сравнению с ЖЖЭ.120y = 0,0006 x + 0,1401R2 = 0,8989Рис.59. Градуировочная зависимость при проявлении «эффектанарушения линейности» при определении ропинирола в плазме крови.Ранее на примере методики определения циклосерина, было установлено,что избыточное содержание матричных компонентов в анализируемой пробеявляется главным фактором при проявлении «эффекта нарушения линейностиградуировочной зависимости».Однако при разработке процедуры сорбционного концентрирования насорбенте Oasis MCX для извлечения ропинирола из плазмы крови возниклитрудности, аналогичные тем, которые мы наблюдали в предыдущем случае – приопределении циклосерина: недостаточная степень извлечения аналита, связаннаяс очень сильными взаимодействиями молекул аналита с сорбентом.
Проблемабыла решена путем применения приема предварительного перевода сорбента ваммонийную форму согласно логике, описанной ранее для циклосерина.Однако,применениеформиатно-аммонийногобуфераоказалосьнеприемлемым в данном случае, поскольку при его использовании аналит плохоудерживался на сорбенте на стадии загрузки образца. Вероятно, ионы аммониядажепрималыхконцентрацияхвзаимодействовалисбольшинством121функциональных групп сорбента, что приводило к невозможности полногоудерживания аналита при загрузке образца.Чтобыснизитьактивностьвзаимодействияионоваммониясфункциональными группами сорбента, в качестве буфера выбрали ацетатаммония вместо формиата на основании предположения о более высокой степенидиссоциации формиата аммония по сравнению с ацетатом.
Показано, что прииспользовании 100 мМ раствора ацетата аммония перед загрузкой на сорбентобразца плазмы крови аналит удерживается на сорбенте полностью. Послезагрузки образца осуществляли промывку сорбента водой и метанолом дляудаления мешающих компонентов плазмы крови, а затем проводили элюированиеаналитов 5%-ым раствором аммиака в метаноле. Степень извлечения ропиниролаи внутреннего стандарта составила, соответственно, 89±5% и 88±4% (n=10).Хроматографическое определение ропинирола также, как и в случаециклосерина,осуществляливрежимеHILICсиспользованиемхроматографической колонки YMC-Pack SIL-06, 100×2.1 mm; S-5µm. Однакоподвижная фаза имела более простой состав: CH3CN:H2O 80:20 (объемн.) сдобавкой 10 мМ формиата аммония.Разработанная процедура пробоподготовки плазмы крови для извлеченияропинироласкатионообменномиспользованиемсорбционногосорбентеMCXOasisконцентрированияпримененаидлянапостроенияградуировочной зависимости.
Показано, что при таком варианте пробоподготовкинаблюдавшийся ранее «эффект нарушения линейности» не проявляется (рис.60).122y = 0,0024 x + 0,0616R2 = 0,9981Рис.60. Градуировочная зависимость после устранения «эффектанарушения линейности градуировочной зависимости» при определенииропинирола в плазме крови.Еще одной особенностью разработки данной методики оказалось наличиена коммерчески производимых картриджах для сорбционного концентрированиянеизвестныхкомпонентов,способныхкоэлюроватьсясропинироломипроявляться на хроматограмме в виде мешающего пика.
Для доказательстваисточника этих мешающих компонентов через новый картридж с сорбентомпропускали 1 мл элюирующей смеси, элюат собирали, растворитель удаляливыпариванием в токе азота, сухой остаток растворяли в ацетонитриле ианализировали. Со временем удерживания ропинирола на хроматограммеобнаруживался пик, по площади в несколько раз превышающий пик ропиниролана уровне LLOQ. Для устранения мешающих компонентов перед началомпроведенияпроцедурысорбционногоконцентрированиячерезсорбентпропускали 1 мл метанола и 1 мл 0.1M NaOH. После такой предварительнойочистки картриджей мешающие пики на хроматограммах не регистрировались.123ГЛАВА V. ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ НАЙДЕННЫХМЕТОДИЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ ПРИ ПРОВЕДЕНИИКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙВсеразработанныемеждународнымиметодикитребованиямиивалидированыапробированывнамисоответствиивсклиническихисследованиях.V.1.
Исследование общей токсичности при проведенииизолированной перфузии легкого раствором цисплатинаС применением разработанной методики определения цисплатина в плазмекрови получены сравнительные данные, позволившие сопоставить общуютоксичность при внутривенном введении и при перфузии изолированного органа(легкого)растворомфармакокинетическиецисплатина.кривыеНадиаграмме(зависимости(рис.61)концентрациипредставленылекарственноговещества в плазме крови от времени) для пациентов, подвергнувшихся перфузии.Пунктирной линией обозначено максимальное содержание цисплатина привнутривенном введении.
Видно, что процедура изолированной перфузиипозволяет добиться значительно меньших концентраций в плазме крови, а значити снизить общую токсичность препарата.124Рис.61. Фармакокинетические кривые цисплатина припроведении изолированной перфузии легкого у 10 пациентов.V.2. Исследования сравнительной фармакокинетики ибиоэквивалентности при пероральном приемеДляостальныхлекарственныхпрепаратовпроведеныоткрытыерандомизированные перекрестные исследования сравнительной фармакокинетикии биоэквивалентности при пероральном приеме взрослыми добровольцами.Обычно в рамках исследования биоэквивалентности сравниваются два препарата:оригинальный препарат – референтный, и дженерик – тестируемый препарат.Такие исследования подразумевают участие здоровых добровольцев, которыеслучайным образом распределяются в две группы. Если препарат имеет высокуюпотенциальную опасность, например, противоонкологический (капецитабин),группы составляют из добровольцев с соответствующим диагнозом.
Каждыйиспытуемый за все время исследования последовательно получает исследуемыйпрепарат (T) и препарата сравнения (R) или наоборот. При отборе крови должнысоблюдаться следующие условия:– кровь отбирается из локтевой вены через катетер;125– первая порция крови (исходная, т.е. до приема препарата) берется утромнатощак через 5-10 минут после установки катетера;– испытуемый принимает исследуемый препарат или препарат сравнения,запивая его 200 мл кипяченой воды;– время отбора последующих проб соответствует программе исследования;пробирки для отбора проб должны иметь маркировку с указанием шифраиспытуемого, номера пробы и названия препарата;– образцы биологической жидкости должны храниться при температуре невыше -20°С;– пробы крови с сопроводительным направлением, в котором указываютсяФИО испытуемого, пол, возраст, масса тела, рост, соответствующие шифру напробирке, предоставляются в фармакокинетическую лабораторию [135].Интервал времени между первым и вторым периодами исследованийназывается «периодом отмывки», и его продолжительность определяется взависимости от фармакокинетических свойств изучаемого препарата (обычно 714 дней).Для определения концентрации действующих веществ в плазме былииспользованы разработанные нами методики.
Проведенная процедура валидациидля каждой из них обеспечивала возможность получения достоверныхлабораторных данных о концентрации действующих веществ при выбранныхусловиях фармакокинетического исследования, в частности, его длительности, иотвечающих общим требованиям селективности определения, повторяемости,правильности и пр.При необходимости (как в случае определения капецитабина) оценкабиологическиактивногоосновываетсянаметаболитасравнениизначений(вданномслучае5-фторурацила)фармакокинетическихпараметров,оцененных непосредственно по данным «концентрация (С) – время (t)» дляисследуемого препарата и препарата сравнения.На основании полученных данных по обоим препаратам для всехиспытуемых проводят статистический обсчет с учетом всех индивидуальных126особенностей добровольцев (возраст, рост, вес и пр.). В результате строятусредненную зависимость концентрации действующего вещества в плазме кровиот времени – фармакокинетическую кривую для каждого препарата (рис.60) ивычисляютплощадипокривойAUC(areaundercurve).Процедурастатистического сравнения состоит в вычислении параметрических двусторонних90%-ных доверительных интервалов для отношений соответствующих среднихзначений AUC для исследуемого препарата и препарата сравнения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
