Диссертация (1150288), страница 11

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 11)

Полученный элюат выпаривали при 30ºС в токе азота, сухой остатокрастворяли в 500 мкл смеси метанол – пропанол-2 (70 : 30 по объему) с добавкой0,05% трифторуксусной кислоты.II.6.4. Пробоподготовка плазмы крови при определении ропиниролаАликвоту 500 мкл плазмы крови, градуировочного раствора или раствораQC помещали в пробирку Эппендорфа, добавляли 5 мкл водного растворациталопрама с концентрацией 100 нг/мл, 500 мкл 100 мМ раствора ацетатааммония и перемешивали в вортексе 3 мин при 1500 об/мин. После этого образцыцентрифугировали 2 мин при скорости 10000 об/мин и температуре 4ºС ипроводили процедуру сорбционного концентрирования на катионообменномсорбенте Oasis MCX.На первой стадии отмывали сорбент 1 мл метанола и 1 мл 0,1 М растворагидроксида натрия. Затем осуществляли кондиционирование сорбента 1 млметанола и 1 мл 100 мМ раствора ацетата аммония и загружали образец плазмы71крови. На стадии промывки через сорбент пропускали 1 мл воды и 1 мл метанола.Элюировали аналиты 1 мл 5%-ого раствора гидроксида аммония в ацетонитриле.После этого выпаривали элюат в токе азота при 30ºС и растворяли сухой остаток в500 мкл ацетонитрила.II.6.5.

Пробоподготовка плазмы крови при определении капецитабина и5-фторурацилаАликвоту 500 мкл плазмы крови, градуировочного раствора либо раствораQC помещали в полипропиленовую пробирку, добавляли 20 мкл водного раствора5-бромурацила (100 мкг/мл), 10 мкл водного раствора капецитабина-d11(100 мкг/мл) и перемешивали в шейкере в течение 2 мин при 1200 об/мин. Затемпроводили процедуру жидкостно-жидкостной экстракции.Для этого добавляли в пробирку 5 мл этилацетата и осуществлялиперемешивание в течение 5 мин при 2000 об/мин, после чего проводилицентрифугирование в течение 5 мин при 4200 об/мин. Затем отбирали изпробирки 4500 мкл надосадочной жидкости в пробирки из борсиликатного стеклаи выпаривали экстрагент в токе азота при 30ºС.

Сухой остаток растворяли в500 мкл воды.II.7. Условия хроматографического и масс-спектрометрическогоопределения аналитовII.7.1. ВЭЖХ-МС условия определения цисплатинаОпределениецисплатинавыполнялинахромато-масс-спектрометреAgilent 1100. На основании серии предварительных экспериментов выбранаподвижная фаза состава: ацетонитрил – 15 мМ ацетато-аммонийный буферныйраствор с рН 4 (85:15, объемн.); скорость потока подвижной фазы 0,25 мл/мин;объем вводимой пробы 20 мкл.72Подобраны условия электрораспылительной ионизации: напряжение накапилляре 2200 В, давление распыляющего газа 40 psig, скорость потока итемпература осушающего газа 10 л/мин и 300ºС, соответственно. Хроматограммызаписывали в режиме регистрации выбранного иона по значению m/z 639,2,соответствующего трехлигандному комплексу платины с ДДТК.Пример хроматограммы приведен на рис.25.MSD1 TIC, MS File (P2415041.D)MSD1 TIC, MS File (P2415040.D)API-ES, Pos, SIM, Frag: 100API-ES, Pos, SIM, Frag: 1001800007000060000500004000030000200001000020123456minРис.25.

Хроматограмма пробы плазмы крови с добавкой цисплатина10 нг/мл (1) и без добавки (2).Условия: хромато-масс-спектрометр Agilent 1100, колонка REPROSYL-PUR C18-AQ,п.ф. ацетонитрил–15мМ ацетато-аммонийный буфер с рН 4 (85:15, объемн.), скорость потокаподвижной фазы 0,25 мл/мин; объем вводимой пробы 20 мкл.Доказательствоструктурыобразующегосявходепробоподготовкикомплекса выполняли на хромато-масс-спектрометре Shimadzu LC-IT-TOF.Условия: колонка YMC-Pack ODS-AQ, п.ф.

85% CH3CN, 15мМ аммонийноацетатный буфер (рН 4), скорость потока 200 мкл/мин, объем ввода 10 мкл, режимсканирования ионов m/z 635-645.73II.7.2. ВЭЖХ-МС/МС условия определения силденафилаОпределение силденафила осуществляли на хроматографе ShimadzuProminence с масс-спектрометром API 4000 в качестве детектора. Составподвижной фазы ацетонитрил – 5 мМ раствор формиата аммония (40 : 60,объемн.), скорость потока подвижной фазы 0,3 мл/мин, объем вводимой пробы5 мкл, температура термостата автодозатора 4ºС. Основные характеристикиионизации и фрагментации представлены в таблице 6. Пример хроматограммысилденафила представлен на рис.

26.Таблица 6. Масс-спектрометрические параметры при определениисилденафилаУсловияПараметрДавление газа соударений (CAD), psiГазовая завеса (CUR), psiДавление осушающего газа (GS1), psiДавление распыляющего газа (GS2), psiНапряжение на игле, VТемпература нагревателей, ºCПотенциал декластеризации (DP), VВходной потенциал (EP), VЭнергия соударений (CE)Выходной потенциал из ячейкисоударений, VMRM переход, m/zВремя, мсПолярностьСилденафилТразодон (IS)610204020006507010756102040200065070104528475,2 → 57,9500(+) положительная372,2 → 147,6400(+) положительная74SILDРис.26. Хроматограммы образцов плазмы крови, несилденафил, и образца с добавкой 1 нг/мл силденафила (SILD).содержащихУсловия: жидкостный хроматограф Shimadzu с масс-спектрометрическим детекторомAPI 4000 (AB Sciex), колонка YMC-Triart C18, п.ф. ацетонитрил – 5 мМ раствор формиатааммония (40:60, объемн.), скорость потока подвижной фазы 0,3 мл/мин, объем вводимой пробы5 мкл.II.7.3.

ВЭЖХ-МС/МС условия определения циклосеринаХроматографическое определение циклосерина проводили на хроматографеShimadzu, совмещенном с масс-спектрометром API 4000 AB Sciex (рис. 27). Врезультате предварительного исследования хроматографического поведенияаналита на обращенно-фазовых (С18) и модифицированных («гидрофильная»дериватизация концевых групп: С18-AQ, Atlantis T3) сорбентах выбран режимHILIC (Hydrophilic interaction liquid chromatography) – жидкостной хроматографиис участием гидрофильных взаимодействий – с использованием подвижной фазысложного состава. Фаза A: метанол-пропанол-2 (70:30, объемн.), 0.075% ТФУ,Фаза B: 0.075% ТФУ в воде. Элюирование осуществляли в изократическомрежиме, 5% фазы В.

Скорость потока подвижной фазы 500 мкл/мин, объемвводимой пробы 1 мкл, температура термостата автодозатора 4 ºС.75Ионизационныехарактеристикиипараметрыфрагментацииприопределении циклосерина представлены в табл. 7.Таблица 7. Параметры ионизации и фрагментации при определениициклосеринаУсловияПараметрДавление газа соударений (CAD), psiГазовая завеса (CUR), psiДавление осушающего газа (GS1), psiДавление распыляющего газа (GS2), psiНапряжение на игле, VТемпература нагревателей, ºCПотенциал декластеризации (DP), VВходной потенциал (EP), VЭнергия соударений (CE)Выходной потенциал из ячейкисоударений, VMRM переход, m/zВремя, мсПолярностьЦиклосеринНиацин (IS)6101420550065044101561014205500650361047614102.9 → 75300(+) положительная123.9 → 80450(+) положительнаяCYCРис.27.

Хроматограммы образцов плазмыциклосерин (CYC), и с добавкой 0.3 мкг/мл (LLOQ).крови,несодержащихУсловия: жидкостный хроматограф Shimadzu с масс-спектрометрическим детекторомAPI 4000 (AB Sciex), колонка YMC-Pack SIL-06, Фаза А:Фаза В в соотношении 95:5. Фаза A:метанол-пропанол-2 (70:30, объемн.), 0.075% ТФУ, Фаза B: 0.075% ТФУ. Скорость потокаподвижной фазы 500 мкл/мин, объем вводимой пробы 1 мкл.76II.7.4. ВЭЖХ-МС/МС условия определения ропиниролаОпределениеропиниролаосуществлялинахроматографеShimadzuProminence с масс-спектрометрическим детектором API 4000. В результатепредварительныхэкспериментоврешеноиспользоватьрежимHILICсприменением подвижной фазы состава ацетонитрил – 10мМ раствор ацетатааммония (80:20, объемн.).

Скорость потока подвижной фазы – 300 мкл/мин, объемвводимой пробы – 20 мкл, температура термостата автодозатора 4 ºС.Ионизационные и фрагментационные параметры определения ропиниролапредставлены в табл. 8.Таблица 8. Параметры ионизации и фрагментации при определенииропиниролаУсловияПараметрДавление газа соударений (CAD), psiГазовая завеса (CUR), psiДавление осушающего газа (GS1), psiДавление распыляющего газа (GS2), psiНапряжение на игле, VТемпература нагревателей, ºCПотенциал декластеризации (DP), VВходной потенциал (EP), VЭнергия соударений (CE)Выходной потенциал из ячейкисоударений, VMRM переход, m/zВремя, мсПолярностьРопиниролЦиталопрам (IS)610505055006507010276105050550065071103588261,1 → 113,8450(+) положительная325,2 → 108,8300(+) положительнаяПример соответствующей хроматограммы представлен на рис.

28.77ROPРис.28. Хроматограммы образцов плазмы крови без добавок и образца сдобавкой 10 пг/мл ропинирола (ROP).Условия: жидкостный хроматограф Shimadzu с масс-спектрометрическим детекторомAPI 4000 (AB Sciex), колонка YMC-Pack SIL-06, п.ф. ацетонитрил – 15мМ ацетат аммония(80:20, объемн.), скорость потока подвижной фазы 300 мкл/мин, объем ввода 20 мкл.II.7.5. ВЭЖХ-МС/МС условия определения капецитабина и 5-фторурацилаОпределение капецитабина и 5-фторурацила осуществляли в градиентномрежиме элюирования с применением двух подвижных фаз (рис.29).Фаза А: 0,1% муравьиная кислота в воде;Фаза В: 0,1%муравьинаякислотавацетонитриле.осуществляли по следующей схеме:Время, мин00,82,53,53,68,5% фазы В0065650StopЭлюирование78Профиль градиента1009080% фазы В706050403020100012345678Время анализа, минРис. 29. Профиль градиента при определении капецитабина и 5-фторурацила.Скорость потока подвижной фазы - 300 мкл/мин, объем вводимой пробы25 мкл; температура термостата автодозатора 4ºС.

Основные характеристикиионизации и фрагментации представлены в табл. 9.Таблица 9. Параметры ионизации и фрагментации при определениикапецитабина (CAP) и 5-фторурацила (FU)УсловияПараметр5-фторурацилДавление газа соударений (CAD), psiГазовая завеса (CUR), psiДавление осушающего газа (GS1), psiДавление распыляющего газа (GS2),psiНапряжение на игле, VТемпература нагревателей, ºCПотенциал декластеризации (DP), VВходной потенциал (EP), VЭнергия соударений (CE)Выходной потенциал из ячейкисоударений, VMRM переход, m/zВремя, мсПолярностьКапецитабин615305-бромурацил(ISFU)6153061010Капецитабин-d11(ISCAP)6101010101010-4500650-31-10-40-4500650-31-10-40-2500650-31-10-40-2500650-31-10-40-15-15-15-15128.9 →42150(-)отрицательная188.9 →42.0150(-)отрицательная358 →153600(-)отрицательная369 → 154800(-)отрицательная79РегистрацияMRM-переходовдля5-фторурацилаи5-бромурацилапродолжалась с начала анализа до 4,4 мин, а затем регистрировалисьMRM-переходы капецитабина и его внутреннего стандарта до окончания анализа.Примеры хроматограмм образца плазмы крови с добавкой капецитабина и5-фторурацила представлены на рис.30.CAP(а)FU(б)Рис.30.

Хроматограммы образцов плазмы крови с добавкой 20 нг/мл(LLOQ) капецитабина (CAP) (а) и 20 нг/мл (LLOQ) 5-фторурацила (FU) (б).Условия: жидкостный хроматограф Shimadzu с масс-спектрометрическим детекторомAPI 4000 (AB Sciex), колонка YMC-Pack ODS-AQ, градиентное элюирование (см. рис.29).Скорость потока подвижной фазы 300 мкл/мин, объем вводимой пробы 25 мкл.80II.8. Валидационные характеристики методовСогласно требованиям EMA (European Medicines Agency) основнымипараметрами биоаналитической методики, подтверждающими эффективность инадежность результатов, являются селективность определения, нижний предел количественного определения, калибровочный диапазон, правильность, повторяемость, матричный эффект, стабильность аналита в биологической матрице и стабильность аналитаи внутреннего стандарта в экстрактах при условиях хранения ипробоподготовки.Значения валидационных параметров для каждой разработанной методики,полученные в соответствии с описанными требованиями, приведены в табл.10.81Таблица 10.

Характеристики

Список файлов диссертации