Диссертация (1150288), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Осаждение белковБиологические матрицы представляют собой сложные смеси эндогенныхкомпонентов, таких как белки, соли, липиды, которые могут взаимодействовать саналитами в процессе разделения и хроматографического определения. Белки, взначительных количествах присутствующие в плазме крови, могут необратимо41адсорбироваться на хроматографической колонке, что приведет к ухудшениюэффективности и резкому сокращению срока службы колонки.Наиболее простой и быстрой процедурой удаления белков биологическойматрицы является их осаждение различными реагентами [88-90].
Наиболеераспространенными осадителями являются такие органические растворители какацетонитрил [91-93], метанол [76, 81], их смесь [80], добавки в органическиерастворители кислот и щелочей [75]. Осаждение белков проводят и сильнымикислотами: муравьиной [94] и хлорной [95]. Применение такого приема позволяетудалить до 98% белков плазмы крови. Процедура осаждения белков являетсябыстрой, недорогой и простой в исполнении и может быть применена дляширокого спектра аналитов [58, 78].Осаждение белков может также использоваться для образцов плазмы илисыворотки крови как стадия очистки, предваряющая жидкостно-жидкостнуюэкстракцию или сорбционное концентрирование [95], [96].
После осаждениябелков проводится центрифугирование и отделение надосадочного слоя, которыйи подвергается анализу. Экспрессность является одним из основных преимуществданного подхода.Однако,еслитребуютсянизкиепределыобнаруженияаналитов,приходится проводить стадию концентрирования. Для этого растворитель изнадосадочной жидкости выпаривают досуха и содержимое перерастворяют вменьшем объеме перед вводом в колонку [97].Основным недостатком осаждения белков считают недостаточную степеньизвлечения.
Так, в [98] отмечают, что степень извлечения аналита при осаждениибелков обычно не превышает 60%, что вызвано соосаждением аналита с белкамиплазмы крови и сложностью биологической матрицы. Кроме того, эффектывлияния остаточных компонентов после осаждения белков (матричные эффекты)выявленыврядемасс-спектрометрическихисследованийсэлектрораспылительной ионизацией. [99, 100]. В основном, это подавлениесигналааналита,несоответствиюприводящеезначенийкнедостаточнойповторяемостиичувствительностиправильностииэкспериментов42установленным валидационным требованиям [42, 54, 79].
Именно эти недостаткиограничивают использование процедуры осаждения белков при разработкеметодик определения лекарственных средств в биологических жидкостях.I.4.2. Жидкостно-жидкостная экстракцияЖидкостная экстракция (ЖЖЭ) – традиционный тип пробоподготовки,который отличается селективностью извлечения, несложной реализацией иневысокой стоимостью.Чаще всего при разработке биоаналитической методики применяютнаиболеепростой–распределительныйвариантжидкостно-жидкостнойэкстракции [101, 102]. Для этого к биологическому образцу, доведенному донеобходимого значения pH, добавляют органический растворитель.
Послеперемешиванияорганическийслойотделяют,удаляютрастворительвыпариванием и производят растворение в подходящем для анализа растворе.Следует отметить, что важную роль при выборе экстрагента играют химическиесвойства аналита. Существует простой способ управления полярностью аналитовкислот и аналитов-оснований с помощью рН. Ионизованные формы являютсягораздо гидрофильнее их нейтральных аналогов. Вследствие этого следуетожидать большее сродство к органической фазе (высокое значение KD) в случае,когда аналит находится в нейтральном состоянии, и, соответственно, – слабое(низкое значение KD), когда молекула аналита полностью ионизована (Рис.17).43Рис.17. Зависимость коэффициента распределения от значения рН среды[103].При этом имеется и промежуточный диапазон, в котором сродство к тойили иной фазе варьируется с изменением рН для частично ионизованных форманалита.
Описываемая кривая аналогична кривой титрования. Точка перегибатакой кривой находится при значении рН, при котором степень диссоциациисоставляет 50% - рКа. Кривые зависимостей «коэффициент распределения - рН»для кислот и оснований качественно являются зеркальными отображениями другдруга. В случае кислот следует ожидать увеличения сродства аналита корганической фазе при низких значения рН, а для оснований – при высоких [104].Наиболеераспространеннымиэкстрагентамиявляютсятрет.бутилметиловый эфир [85, 105-108], этилацетат [74, 82, 109], их смеси сдихлорметаном [77, 110] или гексаном [54, 72]. Для переведения определяемоговещества в форму, необходимую для лучшего извлечения, используют различныеподходы.
Чтобы получить более щелочную среду применяют растворыгидроксида натрия [73, 106, 110] или аммония [85, 105]. Для подкисления плазмыдо необходимого значения рН используют соляную [84] либо муравьинуюкислоту [54]. Широкое применение для этих целей нашли буферы: ацетатноаммонийный [72], фосфатный [97]. Считается, что именно буферы помогают44нивелировать различие в кислотности плазмы крови различных доноров, чтоулучшает воспроизводимость при последующем анализе.При всех преимуществах жидкостно-жидкостной экстракции у нее есть иряд недостатков. К основным можно отнести трудоемкость, времязатратность идовольно большое количество манипуляций с образцом.Тем не менее, эта процедура гораздо более селективна в сравнении сосаждением белков и позволяет достигать высоких степеней извлечения [54, 111,112].I.4.3.
Сорбционное концентрирование (твердофазная экстракция)I.4.3.1. Общие сведения о сорбционном концентрированииМетод сорбционного концентрирования (ТФЭ) предложен более 20 летназад и подобен колоночной хроматографии. Он основан на специфическихвзаимодействиях выделяемого соединения (или мешающих его определениюкомпонентов матрицы) с сорбентом.Типичная схема проведения сорбционного концентрирования приведена нарис.18. Перед началом процедуры сорбент в картридже сухой, поэтому требуетсяего специальная подготовка к работе. Кондиционирование сорбента проводятрастворителем, близким по свойствам растворителю пробы.Так, если проба является водной, то картридж кондиционируют водой.
Прииспользовании неполярных С18-сорбентов при проведении сорбционногоконцентрирования из водных образцов перед кондиционированием водойпроводяттакорганическогоназываемую«активацию»растворителя:сорбентаацетонитриломилинебольшимспиртом.объемомПослекондиционирования через картридж пропускают исследуемый образец. При этоминогда пробе придают определенную кислотность, как в жидкостно-жидкостнойэкстракции, для перевода аналита в необходимую форму. Чаще всего этоподкисление фосфорной кислотой [113-115] или добавка фосфатного буфера снеобходимым значением рН [116].45Рис.
18. Общая схема проведения сорбционного концентрирования[103].Вместе с молекулами аналита на сорбенте удерживаются и многочисленныепримеси из биологической матрицы. На стадии промывки применяютсярастворители (вода, водно-органические смеси, подкисленные/подщелоченныерастворы) для элюирования слабо связанных с сорбентом примесей.Завершающейстадиейявляетсяэлюированиеаналитассорбента.Элюирование стараются проводить как можно меньшим объемом растворителя,который, тем не менее, должен быть достаточным для извлечения целевыхсоединений с картриджа.
При этом некоторые примесные компоненты могутоставаться на сорбенте. Чаще всего элюирование проводят метанолом [84, 104,116], ацетонитрилом [114], добавляя к ним гидроксид аммония [117] илимуравьиную кислоту [115] в зависимости от аналита. После завершенияпроцедуры извлечения аналита полученный элюат выпаривают досуха ирастворяют в подходящем растворителе, при необходимости осуществляяконцентрирование. Иногда элюирование проводят подвижной фазой, чтобы сразуподвергнуть элюат анализу в колонке [54, 118].46Длядостижениясорбционноготребуемыхконцентрированиярезультатовдолжнысвойстваотличатьсясорбентаотдлясвойствхроматографической стационарной фазы.
Например, сорбент смешанного типаили ионообменный для ТФЭ используется в сочетании с хроматографическойколонкой С18. Такая комбинация увеличивает шансы на удаление нежелательныхпримесей [104].Часто для заполнения картриджей используются сорбенты на основесиликагеля с иммобилизованными катионными [116] или анионными [104]функциональными группами. Одним из важнейших достоинств таких сорбентовявляется высокая скорость установления равновесия процессов сорбции идесорбции, позволяющих работать при достаточно быстром пропусканияанализируемой пробы. Другим их преимуществом является постоянство объемасорбента при контакте с органическими и водно-солевыми растворами.
Сорбентына основе силикагеля не требуют длительного предварительного набухания и,после проведения кратковременной активации и кондиционирования (либорегенерации) снова готовы к работе.HLB-картриджи представляет собой модифицированный полистистирол,обладающий одновременно свойствами гидрофильности и липофильности.Аббревиатура HLB (Hidrophylic-Lipophylic Balance) в названии сорбента отражаетдва его важных уникальных свойства: способность оставаться увлажненнымводой и способность удерживать широкий спектр полярных и неполярныхмолекул. Это один из наиболее популярных видов сорбентов для сорбционногоконцентрирования при анализе лекарственных препаратов в плазме крови [113,114, 118].В настоящее время техника сорбционного концентрирования может бытьреализована как в виде отдельных картриджей, так и в автоматизированном96-луночном формате [119, 120].Для ТФЭ характерны более широкие возможности варьирования типоввзаимодействий образца с сорбентом и элюентом, чем для жидкостнойэкстракции, вследствие чего появляются возможности более селективного и47количественного концентрирования и/или извлечения аналитов с участиемспецифическихвзаимодействий(ионообменныемеханизмы,сродствокорганической фазе).Кроме того, следует отметить, что при валидации биоаналитическойметодики применение сорбционного концентрирования практически полностьюобеспечивает соответствие необходимым требованиям по повторяемости иправильности [54, 97].
Тем не менее, у этой процедуры есть и ряд недостатков,основными из которых являются трудоемкость и относительная дороговизна.I.4.3.2. Использование сверхсшитого полистирола при сорбционномконцентрированииСверхсшитые полистиролы – уникальный нанопористый сорбционныйматериал.
В основе получения сверхсшитых полистиролов лежит интенсивноесвязывание цепей полистирола жесткими мостиками. Три фундаментальныхпринципа образуют концепцию формирования сверхсшитых полимерных сетей[121]. Прежде всего, связывание цепей полистирола должно быть статистическигомогенным, то есть сшивающие мостики должны распределяться случайнымобразом в конечной сети. Это достигается за счет однородности исходнойсистемы, содержащей длинные полимерные цепи и сшивающий агент.Согласновторомупринципуполимердолженоставатьсявсольватированном состоянии на протяжении всей реакции. Это значит, чтоиспользуемый растворитель должен быть термодинамически «хорошим» (энергиявзаимодействия растворителя с полимерными цепями превосходит энергиювзаимодействия цепей между собой) как для исходных цепей, так и для конечнойполимернойсетки.Длявыполненияэтогоусловиянеобходимо,чтобысшивающий агент не изменял химической природы полимера, то есть имелблизкие к нему состав и полярность.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
