Диссертация (1150288), страница 8
Текст из файла (страница 8)
И, наконец, образующаяся структураполимера должна быть конформационно жесткой. Это достигается путем48интенсивного связывания довольно подвижных цепей полистирола при помощинегибких сшивающих агентов.Отличительная способность сверхсшитых полистиролов набухать поддействием любых органических жидкостей является следствием основногопринципа формирования сети.
Полимер получают за счет фиксации конформацийсильно сольватированных цепей полистирола при введении большого числанегибких связей между ними. Таким образом, в образующейся сети практическиотсутствует внутреннее напряжение. При высушивании полимера происходит егосжатие, что вызывает сильное внутреннее напряжение. Поглощение любойорганической жидкости приводит к расширению сети и возвращению ее втермодинамически выгодное состояние [121].Из-за своей структуры сверхсшитые полистиролы имеют развитуюповерхность, в то же время способны выдерживать механическое воздействие ивзаимодействовать с любой органической жидкостью независимо от ее природы итермодинамическиххарактеристик.Основноепреимуществотакоготипасорбентов заключается в том, что его поры доступны для низкомолекулярныхсоединений и при этом недоступны даже для низкомолекулярных белков. По этойпричиненетребуетсяникойдополнительнойпробоподготовки:плазма,сыворотка крови или моча могут быть нанесены на картридж непосредственно.Благодаряэтомусверхсшитыеполистиролыобеспечиваютвысокуюэффективность при анализе различных объектов, включая биологические.I.4.4.
Последние достижения в области пробоподготовки плазмы крови канализу при определении лекарственных препаратовПри анализе литературных источников, посвященных различным методампробоподготовки плазмы крови, выделяя их преимущества и недостатки, можносоставить обобщенную схему вариантов пробоподготовки (Рис. 19).49Рис. 19. Обобщенная схема вариантов пробоподготовки плазмы крови прианализе лекарственных препаратов [97].Выбор стратегии пробоподготовки зависит как от химических свойстваналита, так и от умения исследователя оптимизировать процесс.Однимиизсовременныхтенденцийвпробоподготовкеявляютсяминиатюризация, автоматизация, он-лайн пробоподготовка.Миниатюризация реализована в установках для микротвердофазнойэкстракции (МТФЭ).
Она обычно выполняется с помощью волокон икапиллярных трубок с покрытием соответствующей неподвижной фазой.Экстракции или адсорбция аналитов происходит на внешней поверхностиволокна. В другом варианте картридж для МТФЭ представляет собой сменнуюиглу, которая изнутри заполнена определенным адсорбентом. Адсорбентнаходится в микрокартридже в верхней части иглы (Рис. 20).50Рис. 20. Примеры реализации МТФЭ [122].Важным преимуществом МТФЭ является минимальная времязатратность. Враспространенных методах экстракции – жидкостно-жидкостной экстракции иприсорбционномконцентрировании–процедураизвлеченияаналитовпродолжается, по крайней мере, 15-20 мин.
В отличие от них, в методе МТФЭэкстракция занимает на порядок меньшее время, ~ 1-2 мин. Для анализабиологических образцов, где объем пробы часто ограничен, МТФЭ подходитидеально: большое количество образца не требуется.Автоматизация пробоподготовки реализуется как для осаждения белков,так и для экстракций обоих видов [123].
Автоматизация позволяет избежатьгрубых ошибок, увеличить производительность и надежность анализа, уменьшаетвлияние аналитика на результаты.Одним из решений является он-лайн пробоподготовка. Она реализована какдля ЖЖЭ с использованием мембран, так и для ТФЭ [122].
Методы он-лайнжидкостно-жидкостной экстракции основаны на диффузии аналитов из жидкойматрицы (фаза донора) к жидкой фазе акцептора. Мембрана обычно используетсяв качестве фазового разделителя или физического барьера. Подвижная фазапроходит через образец, аналиты поступают сразу в колонку. В качестве мембранвыступают полые волокна, обеспечивающие низкое сопротивление потоку.51Он-лайн вариант ТФЭ в настоящее время достаточно распространен. Дляввода плазмы крови с определяемым веществом в систему необходимопредварительно провести процедуру осаждения белков [83, 97, 124]. Общая схемапроведения он-лайн ТФЭ приведена на рис. 21.
Сначала проба попадает в колонкудля экстракции, затем подвижная фаза извлекает компоненты пробы итранспортирует их в хроматографическую колонку.Рис. 21. Общая схема процедуры он-лайн ТФЭ. (AS – автосамплер, DIL –разбавляющий насос, MS – масс-спектрометр). А – процедура ТФЭ, Б –элюирование [83].Таким образом, миниатюризация, автоматизация, он-лайн пробоподготовкапозволяют снизить время анализа лекарственного препарата в плазме крови, что52особенно актуально, когда в клиническом исследовании задействовано 500-2000образцов.Современная процедура пробоподготовки плазмы крови при определениилекарственных препаратов должна быть не только простой в исполнении,воспроизводимой и относительно недорогой, но и отвечать международнымтребованиям,предъявляемымкбиоаналитическимметодикам,которыеприменяются при проведении клинических исследований.I.5.
Валидация методик определения лекарственных препаратов вплазме кровиI.5.1. Понятие валидацииИзмерение концентрации лекарственных средств в биологических матрицах(сыворотка, плазма, кровь, моча и слюна) является важным аспектом разработкифармацевтических препаратов. Эти данные необходимы для регистрации вгосударственном реестре новых активных субстанций и дженериков. Результатыдоклиническихиклиническихиспытаний,втомчислеисследованийбиоэквивалентности, используются для принятия решений, подтверждающихбезопасность и эффективность лекарственного вещества.
Именно поэтому кразрабатываемымбиологическихметодикамобъектахопределенияпредъявляютсялекарственныхвысокиепрепаратовтребования,встрогорегламентированные на международном уровне. От этого зависит надежностьполучаемых результатов.Валидация биоаналитических методик и анализ исследуемых образцов дляклинических испытаний на людях должны проводиться в соответствии стребованиями надлежащей клинической практики (GCP, Good Clinical Practice).Представленные ниже валидационные критерии полностью соответствуют53действующим рекомендациям Европейского Союза и международным правилам[1].Основная цель валидации методик – продемонстрировать ее надежностьпри определении концентрации аналита в биологической матрице (кровь, плазма,сыворотка, моча или слюна). Кроме того, если в исследуемых образцах плазмыкрови используется антикоагулянт, валидация также должна быть выполнена сприменением этого антикоагулянт.
Полная валидация должна быть проведена длякаждоговидабиологическойматрицывслучае,еслиосуществляетсяпараллельное определение лекарственного препарата сразу в несколькихбиологических объектах.I.5.2. Валидационные критерии, предъявляемые к методикам определениялекарственных препаратов в плазме кровиОсновными характеристиками биоаналитической методики являются:селективность,нижнийпределколичественногоопределения,линейныйдиапазон, повторяемость, правильность, матричный эффект, стабильностьаналита (и внутреннего стандарта) в биологической матрице, в рабочих растворахи растворах хранения на протяжении всего периода исследования.
Обычнотребуется проводить определение одного аналита – лекарственного препарата. Нов случае, если исследование подразумевает определение двух веществ (например,аналит и его метаболит или изомер), принципы валидации применяются длякаждого из аналитов.При валидации методики и анализе клинических образцов, пробыбиологической матрицы с добавками эталонных растворов интересующегоаналита или внутреннего стандарта используются для получения градуировочныхстандартов, образцов контроля качества (quality control, QC) и образцов дляизучения стабильности.54I.5.2.1.
Селективность определенияВыбранный аналитический метод должен позволять различать аналиты,внутренний стандарт, мешающие эндогенные компоненты матрицы или другиекомпоненты образца. Селективность определения должна быть подтверждена сиспользованием образцов матрицы не менее, чем из 6 различных источников,которые должны быть проанализированы индивидуально и оценены на предметприсутствиямешающихкомпонентов.Использованиеменьшегочислаисточников допустимо в случае труднодоступной биологической матрицы(например, спинномозговая жидкость). Методика признается селективной, еслиотклик сигнала мешающих компонентов составляет менее 20% сигнала нижнегопредела количественного определения и 5% – для внутреннего стандарта.I.5.2.2. Нижний предел количественного определенияНижнийпределколичественногоQuantification,LLOQ)представляетопределениясобой(LowerнаименьшуюLimitOfконцентрациюопределяемого вещества в образце, которая может быть количественноопределена с приемлемой повторяемостью и правильностью.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
