Диссертация (1150288), страница 4
Текст из файла (страница 4)
9 представлена схема линейного варианта времяпролетногоанализатора. Ионы, образовавшиеся ионном источнике, ускоряются разностьюпотенциалов источником и сеткой по направлению к детектору. В области дрейфапроисходит разделение ионов по скоростям (следовательно, по массам). Детекторрегистрирует сигнал пучков ионов с одинаковым соотношением массы к заряду.Следует отметить: на детектор поступают все ионы, что существенно улучшаетчувствительность метода по сравнению со сканирующими анализаторами, вкоторых детектора достигает фактически менее одного процента ионов [21].Однако,этонесетвсебеинегативныйэффект–увеличиваетсяичувствительность к большому количеству неизвестных матричных компонентов,прошедших через анализатор.
В случае, если они имеют такие же значения m/z,как и у аналитов, их присутствие может вызывать усиление аналитическогосигнала и приводить к завышению результатов.Времяпролетный масс-анализатор часто применяется в сочетании спредваряющей его ионной ловушкой, например, для изучения белков иустановления аминокислотной последовательности [30].Рис.9. Схема линейного времяпролетного масс-анализатора [27].I.2.3. Тандемная масс-спектрометрия (MC)nМягкие методы ионизации (ХИ, электрораспыление) характеризуютсяинтенсивными пиками молекулярных ионов, однако отсутствие фрагментации22затрудняет установление структуры соединений.
Одним из вариантов решенияэтой проблемы стало использование тандемной масс-спектрометрии. В настоящеевремя эта техника применяется со всеми описанными выше анализаторами ииспользуется для анализа самых разных классов соединений.Современный масс-спектрометр может работать по такому алгоритму:смесь химических соединений сначала разделяется на компоненты, а затемустанавливаются структуры этих компонентов (рис.
10).Рис.10. Принципиальная схема метода тандемной масс-спектрометрии [21].Компонентысмесиионизуютсямягкимметодом.Образовавшиесямолекулярные ионы последовательно проходят через первый анализатор. Вбесполевом пространстве их внутреннюю энергию повышают определеннымобразом, что вызывает фрагментацию. Второй анализатор позволяет получитьмасс-спектр индивидуального соединения.Одним из самых распространенных вариантов активации являетсяактивация соударением или диссоциация, вызванная столкновениями. Онаоснована на высокой кинетической энергии ионов, разогнанных ускоряющимнапряжением. В результате их столкновений с атомами инертного газа в23бесполевом пространстве в камере соударений небольшая часть кинетическойэнергии переходит во внутреннюю.
Приобретенной ионом внутренней энергииможет оказаться достаточно для его распада по одному или несколькимнаправлениям. Число возможных процессов, инициируемых соударениями,весьма велико [21].Ниже представлено несколько наиболее вероятных из них:,где m+ – положительно заряженный ион, m- – отрицательно заряженный ион, m0 –нейтральная частица.Вероятность протекания того или иного процесса зависит от многихпараметров, в том числе от кинетической энергии ионов m+, природы газа идавления в камере. Все многообразие возможных фрагментационных процессовхарактерно и для неизвестных компонентов биологической матрицы.
Посколькуих количество в конечной пробе велико, а природа и свойства могут значительноварьироваться между образцами матрицы разных доноров, высока вероятностьтого, что некоторые неизвестные компоненты будут иметь такую же картинуфрагментации, что и молекулы интересующих аналитов. В этом случаематричные компоненты могут вносить существенный вклад в величинуаналитическогосигнала,чтобудетпроявлятьсявзавышенныхилиложноположительных результатах.Наглядно продемонстрировать возможности МС/МС можно на примереприбора с системой трех квадруполей [31, 32].
Принципиальная схема такогомасс-спектрометра представлена на рис.11 (а), а варианты работы на нем – нарис.11 (б, в).В результате ионизации мягким методом (например, электроспрей)образуются устойчивые молекулярные ионы МН+. Если сканировать напряжениена одном из квадруполей, а другие использовать в режиме пропускания всех24ионов, получится классический масс-спектр, в котором присутствуют только пикимолекулярных ионов. Для получения МС/МС спектра необходимо, чтобы тройнойквадруполь работал следующим образом.Первый квадруполь – в режиме пропускания молекулярных ионов МН+ (приэтом все ионы с другими массами погибнут на его стенках).(а)(б)(в)Рис.11. а – принципиальная схема тройного квадрупольного массспектрометра, б – схема эксперимента для получения спектра дочернихионов, в – схема эксперимента для получения спектра родительскихионов [21].Второй квадруполь должен использоваться в качестве камеры соударений.Через него проходят все ионы, а также подается инертный газ, чаще всего гелийили аргон, для создания давления ~10-2 мм.рт.ст.
Ионы МН+, прошедшие черезпервый квадруполь, сталкиваются во втором квадруполе с молекулами газа. Этистолкновениянаправленынаинициированиепроцессафрагментации,врезультате чего на выходе из второго квадруполя формируются осколочные ионы,образовавшиеся при распаде части ионов МН+.С помощью третьего квадруполя проводится сканирование, котороепозволяет получить спектр соединения, содержащий информацию о массеосновных структурных фрагментов [21].Стоит отметить, что спектры дочерних ионов широко используются вструктурных исследованиях.
Дело в том, что совпадение таких спектров для25исследуемого иона и иона известной структуры является наиболее убедительным,доказательством идентичности структур этих ионов.В современной аналитической химии наиболее часто для решения задач,связанных с определением лекарственных препаратов в сложных биологическихматрицах (например, плазме крови) используют метод тандемной массспектрометрии.Онхарактеризуетсянаиболеевысокойселективностьюопределения аналита и достаточно низкими пределами обнаружения длярешения большинства задач биоаналитической химии. Тем не менее, сложностьбиологической матрицы может вызывать ряд проблем при определениилекарственныхпрепаратов,аименно,подавлениеионизации,усилениеаналитического сигнала, плохая сходимость результатов для образцов матрицыразличных доноров и др.I.3.
Матричный эффект в масс-спектрометрии и способы егоустраненияСтатистический анализ показывает, что высокоэффективная жидкостнаяхроматография (ВЭЖХ) в сочетании с источником ионизации при атмосферномдавлении с масс-спектрометрическим детектированием является оптимальнымметодом количественного определения аналитов в различных биологическихобъектах. При этом компоненты биологической матрицы могут коэлюироватьсясовместно с определяемыми компонентами, влияя на процесс ионизации в массспектрометре [33], подавляя или усиливая ионизацию [34, 35]. Данный феноменвпервые описан Kebarle и Tang в 1993 г. и получил название «матричныйэффект».
[36]Матричный эффект является причиной различий в откликах одного и тогоже определяемого компонента при сравнении подготовленных к анализу образцовв биологическом объекте и чистом растворителе [37, 38].26В принципе, такие ионизационные эффекты могут иметь место как вжидкой, так и в газовой фазе и вызваны главным образом изменениями свойствкапель раствора, обусловленными присутствием нелетучих или малолетучихсоединений. Они и вызывают изменения в характере формирования и испарениякапель, что, в конечном итоге, влияет на количество заряженных ионов,достигающих детектора [38, 39].
Существуют различные версии механизмаподавления ионизации, большинство из которых характерно для двух наиболееиспользуемыххромато-масс-спектрометрическихметодовионизации:электрораспылительной и химической ионизации (ХИ) при атмосферномдавлении (АД).В [40] рассмотрены различные пути подавления сигнала. Этот эффектможет быть обусловлен ограниченным количеством избыточного заряда,доступногокапляммолекуламиопределяемогонаходящихсявнутриэлектроспрея,иликомпонента,капли.насыщениемчтоЭндогенныеповерхностизатрудняеткомпонентыкапливыбросионов,матрицымогутконкурировать с молекулами аналита за заряд на поверхности капли. [40]Согласно другой теории наблюдаемый эффект связан с увеличениемвязкостииповерхностногонатяжениякапель,вызванногопримеснымисоединениями, мешающими испарению растворителя.
Это препятствует переходуопределяемого компонента в газовую фазу [41].Наконец, нелетучие вещества могут уменьшать эффективность образованиясамих капель за счет соосаждения определяемого компонента, что препятствуетдостижению каплями критического радиуса, необходимого ионам для перехода вгазовую фазу.В случае химической ионизации при атмосферном давлении зачастуюналичие ионной супрессии (подавления сигнала) не наблюдается. В отличие отэлектрораспылительной ионизации нет конкуренции между аналитами за переходв газовую фазу, поскольку нейтральные компоненты переходят в газовую фазу врезультате испарения жидкости в потоке нагретого газа [38].27В [42] показано, что при использовании химической ионизации приатмосферном давлении эффект подавления ионизации наблюдался только дляодного из 14 протестированных стандартов, в то время как в режимеэлектрораспылительной ионизации подавление и усиление аналитическогосигнала проявлялось в 12 случаях из 14.
Тем не менее, матричный эффект можетпроявляться несмотря на использование ХИ при атмосферном давлении.В [43] при определении метамфетаминов в меконии при оценке матричногоэффекта значения коэффициента вариации (см. раздел I.5.2.5) достигали 50%.Наблюдаемое подавление ионизации в случае ХИ можно объяснить влияниемсостава образца на эффективность переноса заряда от коронного разряда иглы копределяемому компоненту. Другие возможные механизмы ионной супрессиипри ХИ при атмосферном давлении объясняются образованием твердой фазысамого аналита или соосаждающихся нелетучих компонентов, присутствующих вобразце [44].Эффект подавления или усиления ионизации может быть вызвансовместным элюированием компонентов, попадающих в ионный источник вместес потоком жидкости [45]. Некоторые добавки в подвижные фазы, например,трифторуксусная кислота (ТФУ), влияют на отклик определяемого компонента.Способы снижения ионной супрессии обсуждаются в [39]: использованиекислоты в качестве ион-парного агента, постколоночное введение смесипропионовой кислоты и изопропилового спирта [46], добавка уксусной ипропионовой кислот в подвижную фазу, содержащую ТФУ.
Кроме того,матричный эффект может быть вызван антикоагулянтами, а также полимерами, наоснове которых сделана пластиковая посуда [47].Таким образом, оценке и устранению матричного эффекта должно бытьуделено особое внимание при разработке биоаналитического метода. В [33]подобный эффект даже определен как «ахиллесова пята» хромато-массспектрометрии.28I.3.1. Оценка матричного эффектаПредложено два пути оценки матричного эффекта: метод постколоночного введения [48] и пост-экстракционной добавки [49].Первый позволяет количественно оценить матричный эффект и обнаружитьхроматографическую область наибольшего влияния биологической матрицы.
Вэтом случае насос обеспечивает постоянный поток раствора определяемогокомпонентанавходевионныйисточникмасс-спектрометра(рис. 12).биологическая матрица послепробоподготовки↓ВЭЖХнасосУстройствовводаКолонка→Шприцевой насосраствор аналита→ИонныйисточникМС/МС↑%, интенсивностьВремя (мин)Рис.12. Схематичное изображение метода пост-колоночного введениябиологической матрицы, подготовленной к анализу, для оценки матричногоэффекта. Пунктирной линией обозначен сигнал определяемого компонента,сплошная линия показывает место ввода матричного экстракта [51].Экстракт холостого образца плазмы дозируется в хроматографическую колонку вусловиях,выбранныхдля проведения анализа. Посколькуопределяемоесоединение вводится в масс-спектрометр постоянным потоком, отклик аналита29регистрируется как функция времени.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
