Диссертация (1150288), страница 2
Текст из файла (страница 2)
129 ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ БИОМЕДИЦИНСКИЕ ТЕРМИНЫ ......................... 131 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................... 132 ПРИЛОЖЕНИЕ................................................................................................. 150 Клинические исследования фармацевтических препаратов ............... 150 6ВВЕДЕНИЕАктуальностьПри разработке методик определения лекарственных препаратов в плазмекрови часто возникают проблемы, связанные с мешающим воздействиембиологической матрицы на масс-спектрометрическое определение аналитов.Выявление подобных проблем и поиск путей их устранения весьма актуальны.Это связано, в первую очередь, с бурным развитием фармацевтическойпромышленности и, соответственно, возросшим интересом научного сообществак изучению лекарственных веществ в биологических жидкостях.Измерение концентрации лекарственных препаратов в биологическихматрицах является важным аспектом получения фармацевтических данных.
Онинеобходимы для регистрации в государственном реестре новых активныхсубстанций и дженериков. Результаты доклинических и клинических испытаний,включая исследования биоэквивалентности, используются для принятия важныхрешений, подтверждающих безопасность и эффективность лекарственноговещества.Стремительное развитие фармацевтической отрасли требует разработкикомплексасовременныхвысокочувствительныхвалидированныхметодикопределения как новых лекарственных препаратов, так и дженериков. Высокийуровень требований к подобным методикам строго регламентирован намеждународномуровне[1].Однаконаличиедажесамойсовременнойаналитической аппаратуры не гарантирует успеха без грамотного выборапроцедуры пробоподготовки в связи с многокомпонентностью биологическихматриц.Всовременнойпрактикеопределениялекарственныхпрепаратоввбиологических объектах наиболее предпочтительно использование методовВЭЖХ и хромато-масс-спектрометрии.
При этом компоненты биологическойматрицы могут коэлюироваться с аналитами и обнаруживаться в виде различных7мешающих эффектов: подавление ионизации, усиление аналитического сигнала,плохая сходимость для биообразцов различных доноров и др.Большинство лекарственных веществ имеет высокую степень связывания сбелками крови.
Поэтому при изучении фармакокинетики определение лекарстврекомендуется проводить именно в плазме крови, которая имеет сложнуюматрицу, существенно отличающуюся по составу для разных доноров. Согласномеждународным рекомендациям Европейского Медицинского Агентства (EMA –European Medicines Agency) при использовании масс-спектрометрическогодетектированияматричныйэффектдолженбытьоцененнаобразцахбиологической матрицы не менее шести различных доноров.В большинстве публикаций, посвященных определению лекарственныхвеществ в плазме крови, проблема влияния матрицы не нашла должногоосвещения.Цель работы: установление влияния матричных эффектов на результатыхромато-масс-спектрометрического(цисплатина,силденафила,определенияциклосерина,лекарственныхропинирола,препаратовкапецитабинаи5-фторурацила) в плазме крови и поиск путей его устранения.Вданнойработевкачествеаналитовпредставленыследующиефармацевтические средства: цисплатин и капецитабин – противоопухолевыепрепараты; силденафил – применяется при лечении эректильной дисфункции;циклосерин – антибиотик, включаемый в лекарственную терапию при лечениитуберкулеза, ропинирол – средство против болезни Паркинсона.
Их выборобусловлен высокой терапевтической важностью и недостаточной изученностью.Для реализации цели необходимо было:1.Провестиградациюматричныхэффектовприхромато-масс-спектрометрическом определении лекарственных веществ в плазме крови.2. Выявить характер матричного влияния при ВЭЖХ-МС определениицисплатина,силденафила,циклосерина,ропинирола,капецитабинаи5фторурацила в плазме крови.3.
Нивелировать матричные эффекты при определении всех упомянутых8лекарственных веществ.Научная новизнаПредложен вариант устранения матричного эффекта, выражающегося внеудовлетворительной сходимости результатов для образцов плазмы кровиразличных доноров, при определении цисплатина в форме трехлигандногокомплекса платины и диэтилдитиокарбамата (DDTC) – Pt(DDTC)3+; дляобнаружения цисплатина в биологических жидкостях указанные аналитическиеформы применены впервые.Предложен способ устранения эффекта усиления аналитического сигналапри тандемном хромато-масс-спектрометрическом определении силденафила,основанный на выборе приемлемого осколочного иона (MRM-переход 475→58).Выявлена проблема нарушения линейности градуировочной зависимости,связанная с влиянием компонентов биологической матрицы на ионизацию в массспектрометрии, и предложены способы устранения указанного эффекта за счетснижения объема вводимой пробы при определения циклосерина и выборасорбционного концентрирования катионообменном сорбенте Waters Oasis MCXдля пробоподготовки плазмы крови при определении ропинирола.Применен прием перевода сорбента в аммонийную форму при сорбционномконцентрированиициклосеринаиропиниролаизплазмыкровинакатионообменном сорбенте Waters Oasis MCX.
В предложенном приеме ионыаммония используются в качестве конкурирующего агента, который снижаетпотенциальную возможность взаимодействия молекул аналита с сорбентом, чтооблегчает элюирование и позволяет увеличить степень извлечения аналитов.Установлено, что использование сверхсшитого полистирола PuroSep 200 присорбционномконцентрированиипозволяетустранитьматричныйэффектподавления ионизации при одновременном определении капецитабина и 5фторурацила в плазме крови, а также обеспечить высокие степени извлеченияаналитов (98±2% – для капецитабина и 84±1% – для 5-фторурацила).9Практическая значимость работыРазработанаивалидированавсоответствиисмеждународнымитребованиями методика количественного хромато-масс-спектрометрическогоопределения цисплатина в плазме крови. Предложенная методика применена приизучении общей токсичности при проведении изолированной перфузии легкогоцисплатином (совместно с НИИ Онкологии им.
Петрова).Разработаны и валидированы в соответствии с международными критериямиметодики определения силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина и 5фторурацила в плазме крови методом хромато-масс-спектрометрии. Все методикиприменены при проведении клинических исследований биоэквивалентности вбиоаналитическом центре «ЦКП «Аналитическая Спектрометрия».Положения, выносимые на защиту1. Способыустраненияматричныхвлиянийприхромато-масс-спектрометрическом определении цисплатина, силденафила, циклосерина,ропинирола, капецитабина, 5 фторурацила в плазме крови;2.
Перевод сорбента Waters Oasis MCX в аммонийную форму присорбционном концентрировании как способ решения проблемы сильногосвязывания аналита с сорбентом при определении циклосерина иропинирола.3. Реализация найденных методических решений в фармакокинетическихисследованиях лекарственных препаратов.10ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХI.1. Требования к физико-химическим методам анализа приопределении лекарственных препаратов в биологическихжидкостях для клинических исследованийВ научной литературе обсуждаются различные подходы и методыопределения концентраций лекарственных средств в биологических жидкостях:xроматографические [2, 3, 4], спектрофотометрические [5], полярографические[6, 7], иммунологические (радиоиммунные, иммуноэнзимные) [8, 9] и др.Существует перечень обязательных требований, предъявляемых к методу анализапри проведении клинических исследований: чувствительность, экспрессность,точность, селективность, возможность работы с малым объемом биоматериала,стоимость анализа [10].До недавнего времени для количественного определения фармпрепаратов восновном применяли такие высокоспецифичные и чувствительные методыанализа как радиоиммунный (РИА) [8] и иммуноферментный (ИФА) [9],обеспечивающие определение аналитов на уровне пикограмм.
Долгое время ониявлялись практически единственными источниками информации о содержаниипрепаратов в биологических жидкостях. В основе их лежит специфическаяреакцияантиген-антителосреализациейпринципамолекулярногораспознавания [11, 12]. При этом селективность реакции антитела с конкретнымлекарственным веществом не абсолютна: в присутствии соединений, имеющихблизкое строение, антитело может вступать с ними в перекрестные реакции, чтоприводит к завышению результатов.Так,в[9]приопределении18-гидрокси-11-дезоксикортикостерона(18OH-DOC) и 18-гидроксикортикостерона (18OH-B) радиоиммунным методом вплазме крови наблюдались очень высокие значения относительных ошибок – до88% (табл.
1).11Таблица 1. Содержание 18-OH-DOC и 18-OH-B в плазме крови приодновременном определении [9]День 1АналитДень 2-3День 4-7нмоль/лошибканмоль/лошибканмоль/лошибка18OH-DOC2.02±1.1758%3.27±1.2037%1.35±1.1988%18OH-B14.60±5.9841%18.79±10.2955%8.74±5.3862%Применение микробиологических методов, как правило, ограничиваетсяисследованием средств-антибиотиков. Наличие характеристических особенностейхимическогостроенияпрепаратов,например,присутствиеамино-игидроксигрупп в молекулах антибиотиков и иммунодепрессантов обуславливаетвозможность образования окрашенных комплексных соединений с солямитяжелых металлов, которые могут быть обнаружены спектральными методами.Однако они не удовлетворяют условиям экспрессности определения [13].Длярешенияфармакокинетикиизадачтерапевтическогофармакодинамикилекарственногоиспользуютсямониторингавысокоэффективнаяжидкостная хроматография (ВЭЖХ) [3, 4], высокоэффективная тонкослойнаяхроматография (ВЭТСХ) [7], газовая хроматография (ГХ) [14], капиллярныйэлектрофорез (КЭ) (рис.1) [15] и электрохимические методы анализа (ЭХ) [16].12Рис.1.
Электрофореграмма образца плазмы крови пациента послеприема 50 мг препарата топирамата (TPR). В образец плазмы добавлено25 мкг/мл внутреннего стандарта – габапентина (IS) [15].Среди хроматографических методов наибольшее распространение приопределениилекарственныхпрепаратовполучилаОФВЭЖХсоспектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием [17-19](рис.2).МетодУФраспространенным,детектированияоднако,еговВЭЖХосновноехотьиограничениеявляется–наиболеенедостаточнаячувствительность при определении минорных концентраций лекарственныхсредств в сложной многокомпонентной матрице [20].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
