Диссертация (1150288), страница 6
Текст из файла (страница 6)
В [51] показано, что в случаекапилляров или колонок с очень малым внутренним диаметром (<0,5 мм) методыэлектрораспылительнойионизацииоказываютсяменееприсутствиюмешающихкомпонентовбиологическойвпробевосприимчивыкматрицы.Матричный эффект в диализате был оценен на различных концентрационныхуровняхокскарбазепинаиегоглавногометаболитасиспользованиеммикроколоночной, капиллярной и нано-ВЭЖХ-МС/МС систем [51, 60].Отмечено, что при низкой скорости потока уменьшается размер заряженныхкапель и снижается объем растворителя, который необходимо испарить дляперехода ионов в газовую фазу.
Это приводит к уменьшению концентрациипримесей [60, 61]. В [62] наблюдалось подавление ионизации, вызванноематричным эффектом, при введении плазмы крови и мочи в условияхтрадиционной ВЭЖХ.36Напротив, при определении пяти препаратов класса антидепрессантов в техже биологических объектах методом капиллярной ВЭЖХ матричный эффект небыл выявлен [63].I.3.3.3. Использование внутреннего стандарта для устранения матричногоэффектаВ качестве внутреннего стандарта можно использовать либо вещество,близкое по структуре к определяемому компоненту, либо стандарт, меченыйстабильным изотопом.
Однако биологическая матрица может по-разному влиятьна внутренний стандарт-аналог и само определяемое соединение. Возможноерешение данной проблемы – использование изотопно-меченого внутреннегостандарта, который коэлюируется с определяемым компонентом. Матричныйэффект не должен влиять на относительную эффективность ионизации аналита иего меченого внутреннего стандарта.Изотопно-меченый внутренний стандарт – это соединение, имеющее такуюже, как у определяемого компонента, структуру, где некоторые атомы в ихмолекулах заменены на стабильные изотопы: 2H (D),13C,15N или17O.
Важно,чтобы разница в массе определяемого соединения и меченого внутреннегостандарта была не менее 3 Да [64] во избежание вклада содержания природныхизотопов в сигнал внутреннего стандарта.В [60] отмечено, что использование внутреннего стандарта, меченогостабильными изотопами (13С6, 15N), необходимо при количественном определенииангиотензина в образцах микродиализата мышиного мозга, поскольку прииспользовании структурного аналога норлейцина в качестве внутреннегостандарта необходимые значения точности и достоверности метода получить неудавалось. В то же время в [65] показано, что использование меченоговнутреннего стандарта не всегда гарантирует постоянство соотношения площадейопределяемыйкомпонент/внутреннийстандарт.Приразработкеметодаопределения мевалоновой кислоты в моче наблюдался очень большой матричный37эффект, зависящий от источника мочи и объема образца, взятого для экстракции.Кроме того, отношение откликов определяемого соединения и внутреннегостандарта изменялось относительно ожидаемого значения, указывая на то, чтоматричный эффект в разной степени влиял на аналит и на внутренний стандарт.В [66] установлено, что дейтерированный внутренний стандарт не всегдаприменимдлякомпенсациинаблюдаемогоматричногоэффекта.Заменауглеродно-водородной связи на связь с дейтерием немного меняет липофильностьмолекулы и, следовательно, при использовании обращенно-фазовой ВЭЖХ можетповлиять на разделение определяемого компонента и его дейтерированноговнутреннего стандарта.
Если при элюировании аналита и внутреннего стандартанаблюдается проявление сильного подавления ионизации в узком временноминтервале, то небольшое различие в удерживании может вызвать проявлениематричного эффекта [64]. 13C-, 15N- или 17O-меченые внутренние стандарты могутоказаться более подходящими, чем дейтерированные, поскольку водород идейтерий различаются по физическим свойствам гораздо сильнее, чем, например,12C и 13C [67, 68].При этом, даже если используется меченый внутренний стандарт,матричный эффект необходимо контролировать. Если гашение ионизациисущественно уменьшит сигнал определяемого компонента и/или внутреннегостандарта, отношение сигнал/шум может достичь такого значения, когда точностьи достоверность не попадут в допустимые пределы [39].Дополнительные проблемы возникают, когда в биоаналитическом методенеобходимо определение сразу нескольких компонентов.
В этом случае требуетсястолько меченых внутренних стандартов, сколько компонентов определяется.Воздействие компонентов биологической матрицы при определениилекарственных препаратов значительно осложняет разработку методик иможет существенно сказываться на достоверности получаемых результатов,что недопустимо при проведении клинических исследований. Несмотря наактуальность проблемы матричного эффекта, ей уделяется незаслуженно малое38внимание при разработке методик определения лекарственных препаратов вбиологических жидкостях. Процедура пробоподготовки плазмы крови к анализуиграет первостепенную роль при удалении матричных компонентов образца.I.4.
Пробоподготовка плазмы крови к ВЭЖХ-МС анализу приопределении лекарственных препаратовБольшинство аналитических приборов, и системы ВЭЖХ-МС, в частности,не имеют технической возможности определять малые количества лекарственныхпрепаратовнепосредственноприинжектированииобразца.Матрицыбиологических объектов часто очень сложны. Отделить аналит от компонентовбиологической матрицы (плазмы крови) и подготовить его к вводу в прибор –основные задачи, решаемые с помощью различных подходов пробоподготовки.Наличиеграмотногодажевыборасамойсовременнойстратегиипроцедурыаналитическойаппаратурыпробоподготовкинебезможетгарантировать успеха при разработке методики определения лекарственногопрепарата в плазме крови. Это связано не только с предельно низкимиконцентрациями основных активных компонентов лекарственных средств (ЛС) иих метаболитов, но и с биологической активностью определяемых соединений,термолабильностью,многокомпонентностьюматрицыобразца,наличиемоптических изомеров [69].
Именно поэтому правильный выбор процедурыпробоподготовки часто является ключевым моментом при разработке методикиопределения лекарственного препарата в плазме крови.При проведении практически любого исследования подготовка пробы канализу занимает наибольшее количество времени рис. 16. Кроме того, онаявляется источником более 30% ошибок количественного определения аналитов.396%Подготовка пробы27%Отбор пробы61%6%АнализОбработка данныхРис. 16. Примерные затраты времени (%) исследователя при проведениианализа [70].Таким образом, при выборе схемы подготовки проб к анализу необходимоучитывать не только его надежность и точность, но и такие факторы как простотаэксплуатации, время, необходимое для выполнения процедуры.Современными тенденциями в пробоподготовке являются миниатюризация,автоматизация, он-лайн соединение с аналитическим прибором, уменьшениерасхода растворителей и увеличение скорости и безопасности (особенно прииспользованииматериала).потенциальноМинимизацияинфекционныхколичествастадийобразцовприбиологическогоподготовкеобразцовнеобходима для снижения возможных ошибок, что приводит и к повышениюточности.Автоматизированныеметодыпробоподготовкитакжевесьмаэффективны в плане экономии времени, улучшения воспроизводимости, но приэтом включают и дополнительные расходы [70].Кроме того, часто требуется количественное определение не одногоаналита, а целой группы, что имеет место, например, при анализе в плазме кровидействующего лекарственного препарата и его метаболитов [71-74].
Еще однойпричиной необходимости определения группы аналитов в плазме крови являетсяоптимизация комплексной терапии, когда пациенту назначают сразу несколькопрепаратов, концентрация которых контролируется [75-77].Описаныпримерысодновременнымопределением10аналитовпсихотерапевтического действия [78], 13 противовоспалительных препаратов40[79],15противовирусныхпрепаратов[80].Соответственно,методпробоподготовки должен учитывать химическую специфику всех аналитов.Применениеметодавнутреннегостандартадляколичественногоопределения лекарственных препаратов в плазме крови уже давно считаетсястандартным приемом.
Существуют общие стратегии выбора внутреннегостандарта: он должен иметь близкую по отношению к определяемым веществамструктуру, сопоставимые коэффициенты распределения. Нередко применяютвнутренние стандарты, меченые изотопными атомами [74, 77-85]. По сути, это –то же самое анализируемое вещество с массой, отличающейся на один илинесколько Да. Их идентичное химическое поведение позволяет повыситьвоспроизводимость и снизить матричный эффект. Однако стоимость подобныхстандартов довольно высока. Авторы [86] предлагают синтезировать меченыевнутренние стандарты непосредственно в лаборатории методом метаболическойинкубации. Другой подход предложен в [87], а именно: методика выборадериватизирующих агентов, аналогичных определяемому аналиту, которые будутвыступать в качестве внутренних стандартов. Метод получил название изотопнокодовойдериватизации(ИКД)[87].Применяютреагентыдлямеченияфункциональных групп в аминах, карбоновых кислотах, тиолах, спиртах и др.Выделяют три основных подхода при подготовке биологической матрицы канализу: осаждение белков, жидкостно-жидкостная экстракция и сорбционноеконцентрирование (твердофазная экстракция).I.4.1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
