Диссертация (1150288), страница 9

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 9)

LLOQ считаетсяградуировочным стандартом с самой низкой концентрацией. Кроме того, сигналанализируемого образца LLOQ должен быть, по крайней мере, в 5 раз большесигнала холостого образца и при этом адекватно соотноситься с ожидаемымнижним уровнем концентраций лекарственного препарата в реальных образцахклинического исследования.При исследовании биоэквивалентности LLOQ должен быть не выше, чем5% от максимальной концентрации (Cmax).55I.5.2.3. Линейный диапазонОтклик прибора на концентрацию определяемого вещества должен бытьизвестениоцененвопределенномконцентрационномдиапазоне.Градуировочные стандарты следует готовить в той же матрице, что и образцыклинического исследования путем добавки эталонных растворов с известнойконцентрацией аналита.

В идеальном случае перед выполнением валидациианалитическойметодикидолженбытьизвестеножидаемыйдиапазонконцентраций. Этот диапазон должна полностью включать градуировочнаякривая, определяемая LLOQ – самым низким по концентрации градуировочнымстандартом, и верхним пределом количественного определения (Upper Limit OfQuantification, ULOQ), являющимся градуировочным стандартом с самой высокойконцентрацией. Концентрационный диапазон должен быть создан таким образом,чтобыобеспечитьадекватноеописаниефармакокинетикиопределяемоговещества.

При построении градуировочной кривой должны использоваться какминимум 6 уровней концентрации, холостой образец (матрица без добавкианалита и внутреннего стандарта) и образец матрицы с добавкой внутреннегостандарта). Для каждого градуировочного уровня повторно проанализируют неменее 3 образцов. Для описания градуировочной кривой применяют зависимость,которая адекватно описывает отклик прибора на концентрации определяемыхвеществ. При расчете параметров градуировочной кривой холостой образец иобразец матрицы с добавкой внутреннего стандарта не должны приниматься вовнимание.Для градуировочной зависимости рассчитывают ее параметры (наклон исвободныйчленвслучаелинейнойаппроксимации).Поуравнениюградуировочной зависимости площади пика аналита от его концентрации (илиотношения площадей от отношения концентраций для аналита и внутреннегостандарта) вычисляются расчетные значения концентраций градуировочныхстандартов, а также значения повторяемости и правильности для трехпараллельных образцов на каждом градуировочном уровне.

Расчетные значения56концентраций градуировочных стандартов должны быть в пределах ±15% отноминального значения, за исключением LLOQ, для которого они должны быть впределах ±20%. По крайней мере, 75% градуировочных стандартов для шести(минимум) концентрационных уровней должны соответствовать этому критерию.При повторных анализах необходимо, чтобы заданные критерии повторяемости (впределах±15%и±20%для LLOQ)выполнялисьминимум для50%протестированных градуировочных стандартов на каждый концентрационныйуровень.I.5.2.4. ПравильностьПравильность аналитической методики описывает близость определенногозначения,полученногосеепомощью,кноминальнойконцентрацииопределяемого вещества (выраженную в процентах).

Правильность оцениваетсяна образцах с добавками известных количеств аналита – образцах контролякачества (QC-образцах, quality control samples). QC-образцы должны бытьполучены независимо от градуировочных стандартов с использованием отдельноприготовленных эталонных растворов. QC-образцы анализируют, и рассчитанныепо градуировочной кривой концентрации сравнивают с номинальным значением.Правильность выражается в процентах от номинального значения и оценивается врамках одной, а также между аналитическими сериями.Внутрианалитическойсерииправильностьопределяютнаосновеединичных анализов 5 образцов для каждого из четырех концентрационныхуровней: LLOQ, уровень утроенного значения концентрации LLOQ (нижний QC),уровень приблизительно в середине градуировочного диапазона (средний QC) иуровень не ниже 75% от верхней границы линейного диапазона (верхний QC).Усредненная концентрация должна быть в пределах 15% от номинальногозначения для QC-образцов за исключением LLOQ, для которого она должна бытьв пределах 20% от номинального значения.57Для валидации правильности между аналитическими сериями LLOQ,нижний, средний и высокий QC-образцы анализируют не менее, чем в треханалитических сериях, по крайней мере в 2 разных дня.

Средняя концентрациядля каждого уровня QC должна быть в пределах 15% от номинального значения,за исключением LLOQ, для которого она должна быть в пределах 20% отноминального значения.I.5.2.5. ПовторяемостьПовторяемость аналитической методики описывает степень близости друг кдругурезультатовизмеренийдляидентичныхобразцов.Повторяемостьвыражается в виде коэффициента вариации (coefficient of variation, CV) и должнабыть продемонстрирована на LLOQ, нижнем, среднем и верхнем QC-образцах врамках одной серии, а также между аналитическими сериями (аналогичноправильности). Коэффициент вариации рассчитывается по формуле (1):CV гдеX 100%,(1)( x1  x) 2  ( x 2  x) 2  ...  ( x n  x) 2n– среднеквадратическое отклонение.Для валидации повторяемости внутри аналитической серии должно бытьпроанализировано не менее пяти проб с концентрациями на уровне LLOQ,нижнего, среднего и верхнего QC-образцов.

Значение CV не должно превышать15% для образцов контроля качества, за исключением LLOQ, где превышение недолжно составить 20%.При валидации повторяемости между аналитическими сериями оценкадолжна быть выполнена для концентраций LLOQ, нижнего, среднего и верхнегоQC-образцов,покрайнеймере,втреханалитическихсериях,проанализированных минимум в два разных дня. Значение CV не должнопревышать 15% для QC-образцов и 20% для LLOQ.58I.5.2.6. Матричный эффектМатричный эффект должен быть исследован при масс-спектрометрическомдетектировании не менее, чем на 6 образцах биологической матрицы различныхдоноров.

Объединение различных матриц для этой цели недопустимо. Длякаждого определяемого соединения и внутреннего стандарта необходимо оценитьматричный фактор (MF) для этих 6 матриц. Он вычисляется как отношениеплощади пика аналита в присутствии матрицы (матрица после экстракции сдобавлением в нее аналита) к площади пика в отсутствии матрицы (чистыйраствор аналита):MF S1S2,(2)где S1 – площадь пика для пробы с добавкой аналита в матрицу после её пробоподготовки,S2 – площадь пика для стандартного раствора аналита.Матричныйфактор,нормализованныйнавнутреннийстандарт,определяется отношением MF аналита к MF внутреннего стандарта:MFнорм (%) MFаналит100MFвнутр.станд.(3)Значение CV нормализованных матричных факторов для 6 различныхматриц не должно превышать 15%. Контроль матричного эффекта следуетпроводить на нижнем и верхнем уровнях концентраций [1].Если лекарственный препарат содержит добавки (например, такиенаполнители, как полиэтиленгликоль или полисорбат), отвечающие за матричныеэффекты, последние должны исследоваться на образцах биологической матрицы,содержащей эти добавки.I.5.2.7.

Стабильность аналитовСтабильностьаналитовнеобходимооцениватьвопробоподготовки и анализа проб, а также в условиях хранения.всехусловиях59Стабильность аналита в исследуемой матрице оценивается на нижнем иверхнем QC (из 5 параллельных проб для каждого уровня), которые определяютсясразу же после приготовления и после хранения в соответствующих условиях.Полученнаяконцентрация(поградуировочнойкривой)сравниваетсясноминальной концентрацией. Рассчитанное значение концентрации на каждомуровне должно находиться в пределах ±15% от номинального значения.Требуется, чтобы условия, используемые в экспериментах по определениюстабильности, соответствовали и условиям при анализе образцов клиническогоисследования.1)Стабильность замораживания и размораживания.

Образцы QCследует хранить при определенной температуре (-20°С) в морозильной камере втечение не менее 12 ч и разморозить без посторонней помощи при комнатнойтемпературе. После полного размораживания образцы должны быть зановозаморожены не менее, чем на 12 ч при тех же условиях. Число цикловзамораживания-размораживания должно быть равно или больше, чем таких жециклов для образцов клинического исследования (обычно, 3 цикла)2)Краткосрочнаятемпературнаястабильность.ОбразцыQCнеобходимо разморозить при комнатной температуре, выдержать при этойтемпературе от 4 до 24 ч (в зависимости от ожидаемой продолжительностинахожденияобразцаприкомнатнойтемпературедоисследования)ипроанализировать.3)Долгосрочная стабильность. Время хранения образцов QC при оценкедолгосрочной стабильности должно превышать время между датой полученияпервого образца и датой анализа последнего образца (обычно 1-2 месяца).Приемлемым считается определение стабильности при -20°С или -70°С.4)Стабильность образцов после пробоподготовки в автодозаторе.Образцы QC необходимо приготовить и проанализировать, после чего оставить вавтодозаторе при определенной температуре (обычно +4°С или комнатной),выдержать от 4 до 24 часов и проанализировать повторно.605)Стабильность стандартных и рабочих растворов.

Стабильностьрастворов хранения фармацевтических препаратов и внутреннего стандартаследует определять при комнатной температуре или в охлажденном состоянии втечение не менее 6 ч. После завершения требуемого срока хранения должна бытьпроверена стабильность по отношению к свежеприготовленным растворам путемсравнения откликов аналитического прибора.Представленная работа направлена на освещение вышеперечисленныхпроблем, поиск матричных эффектов и путей их устранения.61ГЛАВА II. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ ИМЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯII.1. АппаратураРабота выполнялась на хромато-масс-спектрометрах: Agilent 1100 (рис.22),включающий насос (G1310A), автоматический дозатор (G1329A), термостат(G1330A)имасс-спектрометрическийдетекторсэлектрораспылительнойионизацией и квадрупольным масс-анализатором (G1946A); высокоэффективныйжидкостный хроматограф Shimadzu Prominence с дегазатором (DGU-20A5), двумяградиентными насосами (LC-20AD), термостатируемым автодозатором (SIL20AC), соединенный с масс-спектрометром API 4000 AB Sciex с электроспрейионизацией и тройным квадрупольным масс-анализатором (рис.22); хроматомасс-спектрометрShimadzuсэлектрораспылительнойионизацией,времяпролетным масс-анализатором и ионной ловушкой.

Характеристики

Список файлов диссертации