Диссертация (1150288), страница 10
Текст из файла (страница 10)
При определениианалитов использовали различные хроматографические колонки (табл.2).Рис.22. Хромато-масс-спектрометр Agilent 1100 (слева) ихроматограф Shimadzu Prominence, соединенный с масс-спектрометром API4000 AB Sciex (справа).62Таблица 2. Хроматографические колонки, использованные в работеНазвание колонкиREPROSYL-PUR C18-AQYMC-Triart C18YMC-Pack SIL-06YMC-Pack SIL-06YMC-Pack ODS-AQХарактеристики100×2.0 мм, 3 мкм50×2.1 мм, 3 мкм150×4.6 мм; 3 мкм100×2.1 мм; 5 мкм100×2.1 мм, 5 мкмАналитЦисплатинСилденафилЦиклосеринРопиниролКапецитабин и 5-фторурацилПри пробоподготовке плазмы крови к анализу использовали микродозаторыпеременного объема Biohit mLINE; шейкер Heidolf Multi Reax; термостатBIOSAN CH-100 с функцией нагрева и охлаждения (-10°С – 100°С); систему дляпробоподготовки Waters (рис.23) с вакуумным насосом GAST; систему длявыпариванияTurboVapРис.23.
Системаконценрирования.LVWaters(Calliper)для(рис.24);проведенияцентрифугипроцедурыEppendorfсорбционного63Centrifuge 5415R и 5702R; электронные весы Ohaus Discovery DV215CD (пределдопускаемой погрешности ±0,01 мг, класс точности – А).Для исследования стабильности аналитов использовали биомедицинскийморозильники Sanyo (-40ºC – -18ºC и -80ºC – -60ºC).Деионизованную воду (далее «воду») получали с помощью станции очисткиводы Millipore Milli Q Advantage A10.Рис.24.
Система для выпаривания TurboVap LV.II.2. РеагентыДля приготовления подвижных фаз и проведения пробоподготовкииспользовали ацетонитрил (Biosolve, HPLC Grade), метанол (Merck, HPLC Grade),пропанол-2 (ВЕКТОН, х.ч.), этилацетат (ВЕКТОН, 99,7%), ацетат аммония (Sigma64Aldrich, ≥98%), формиат аммония (Sigma Aldrich, ≥99%), уксусную кислоту(Sigma-Aldrich,≥99,7%),муравьинуюкислоту(Sigma-Aldrich,98%),трифторуксусную кислоту (Merck, for protein sequence analysis), соляную кислоту(Sigma-Aldrich, 37%), натрия диэтилдитиокарбамат (ДДТК) тригидрат (ВЕКТОН,ЧДА), гидроксид натрия (Merck, 99%), раствор гидроксида аммония (SigmaAldrich, 28-30%), воду, очищенную с помощью системы Milli Q Advantage A10(далее везде «воду»), сорбционные патроны Waters Oasis HLB (30 мг, 1 мл), SepPac®Vac tC18 (100 мг, 1 мл), Oasis MCX (30 мг, 1 мл), сверхсшитый полистиролPurosep 200.Определяемые аналиты.
Список стандартных веществ, использованных вработе, приведен в табл. 3.Таблица 3. Стандартные вещества, использованные в работеНазваниеЦисплатинЦитрат силденафилаГидрохлорид тразодонаD-ЦиклосеринНикотиновая кислота (ниацин)Ропинирола гидрохлоридS-циталопрама оксалатКапецитабинКапецитабин-d115-фторурацил5-бромурацилПроизводительSigma-AldrichSynfine researchSigma-AldrichLKT Laboratories, IncSigma-AldrichLKT Laboratories, Inc.Toronto Research Chemicals Inc.Cayman Chemical CompanyTLC PharmaChemLKT Laboratories, Inc.Toronto Research Chemicals Inc.Чистота99%99,7%99%99,3%100%99%99,8%100%98%99,5%98%II.3. Приготовление стандартных растворов аналитовСтандартный раствор цисплатина с концентрацией 1 мг/мл готовилирастворением точной навески 10 мг цисплатина в 10 мл воды и хранили при +4ºСв течение 1 месяца. Рабочие растворы цисплатина (10, 1, 0.1 мкг/мл), а такжеградуировочные растворы (10, 20, 50, 100, 200, 400 нг/мл) готовили ежедневнопоследовательным разбавлением стандартного раствора плазмой крови.65Индивидуальныестандартныерастворысилденафилаитразодона(внутренний стандарт) с концентрациями 1 мг/мл готовили в мерных колбахвместимостью 10 мл растворением 10 мг цитрата силденафила или гидрохлоридатразодона в метаноле.
Полученные растворы хранили при -25ºС. Из стандартногораствора силденафила путем последовательного разбавления плазмой кровиготовили градуировочные растворы (1, 5, 10, 50, 100, 500 и 1000 нг/мл) ирастворы для контроля качества QC (3, 180, 800 нг/мл).Стандартный раствор циклосерина с концентрацией 1 мг/мл готовили встеклянной мерной колбе вместимостью 10 мл растворением навески 10 мг в 0,1MHCl. Полученный раствор стабилен при +4ºС в течение 1 месяца. Дляприготовлениястандартногораствораниацина(внутреннийстандарт)сконцентрацией 1 мг/мл навеску 10 мг никотиновой кислоты помещали в мернуюколбу вместимостью 10 мл и растворяли в метаноле.
Готовый раствор стабиленпри -25ºС в течение 1 месяца. Из стандартного раствора циклосерина путемпоследовательногоразбавленияплазмойкровиготовилиградуировочныерастворы с концентрациями циклосерина 0.3, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30 мкг/мл ирастворы для контроля качества QC (0.75, 7.5, 25 мкг/мл).Стандартный раствор ропинирола с концентрацией целевого вещества0.877 мг/мл готовили в мерной колбе вместимостью 10 мл растворением точнойнавески гидрохлорида ропинирола (10 мг) в метаноле. Полученный растворропинирола хранили при -25ºС.
Из стандартного раствора ропинирола готовилиградуировочные растворы с концентрациями 10, 20, 50, 200, 500, 1000, 2000 пг/мли растворы контроля качества QC с концентрациями 30, 300, 1600 пг/мл путемпоследовательного разбавления в плазме крови.Стандартный раствор циталопрама с концентрацией целевого вещества0.783 мг/мл готовили в мерной колбе на 10 мл растворением точной навескиоксалата S-циталопрама (10 мг) в метаноле.
Полученный раствор хранили в при 25ºС.Стандартный раствор капецитабина с концентрацией 10 мг/мл готовили вмерной колбе вместимостью 10 мл растворением точной навески 100 мг66капецитабина в метаноле. Стандартные растворы 5-фторурацила, 5-бромурацила,капецитабина-d11 с концентрациями 1 мг/мл готовили индивидуально в мерныхколбах на 10 мл растворением точных навесок 10 мг соответствующих веществ вметаноле. Полученные стандартные растворы хранили при -25ºС в морозильнойкамере. Из стандартных рабочих растворов капецитабина и 5-фторурацила путемпоследовательного разбавления в плазме крови готовили градуировочныерастворы с концентрациями капецитабина 20, 100, 500, 1200, 2000, 2800,4000 нг/мл и 5-фторурацила 20, 40, 100, 200, 300, 500, 800 нг/мл, а также растворыобразцов контроля качества с концентрациями капецитабина 30, 800, 3000 нг/мл и5-фторурацила 50, 240, 700 нг/мл.II.4. Приготовление вспомогательных растворовВспомогательныерастворыготовилипутемаккуратногосмешениякомпонентов в определенном соотношении (табл.
4). Все полученные растворыхранили в холодильнике при +4ºС.Таблица 4. Приготовление вспомогательных растворовНаименованиераствора0,2 М растворгидроксида натрия0,1 М растворгидроксида натрия0,04 М растворгидроксида натрия1 М раствормуравьинойкислоты1 М формиатноаммонийныйбуфер, рН 2.5(«Буфер 1»)0,1 М формиатно-Объемраствора 1Раствор 2Объемраствора 26 млВода24 мл3 млВода27 мл1,2 млВода28,8 млHCOOH,конц.385 мклВода9615 мкл1М р-рHCOOH9 мл1М р-рHCOONH41 мл«Буфер 1»3 млВода27 млРаствор 11М р-рNaOH1М р-рNaOH1М р-рNaOH67аммонийныйбуфер, рН 2.8(«Буфер 2»)0,1 М растворацетата аммония1 М растворсоляной кислоты0,1 М растворсоляной кислоты0,07 мМ растворсоляной кислоты вметаноле20%-ный раствортрифторуксуснойкислоты2%-ный растворуксусной кислотыв ацетонитриле30%-ный растворметанола50%-ный растворацетонитрила5%-ый растворгидроксидааммония вметаноле5%-ый растворгидроксидааммония вацетонитрилеРаствор дляперерастворенияпроб (приопределениициклосерина) *1М р-рH3СCOONH4HCl,конц.1 М р-рHCl3 млВода27 мл4,17 млВода10 мл1 млВода9 мл0,1 М р-рHCl15 мклМетанол20985 мклТФУ,конц.1 млВода4 млH3CCOOH,конц.500 мклАцетонитрил9500 мклCH3OH30 млВода70 млCH3CN15 млВода15 мл30%-ныйNH3·H2O,(конц.)5 млМетанол25 мл30%-ныйNH3·H2O,(конц.)5 млАцетонитрил25 млCH3OH21 млПропанол-29 мл* с добавкой 75 мкл 20%-ого р-ра ТФУ68Некоторые вспомогательные растворы готовили из твердых веществ путемрастворения навесок в соответствующем растворителе (табл.
5). Все полученныерастворы хранили в холодильнике при +4ºС.Таблица 5. Приготовление вспомогательных растворов из твердыхреагентовНаименованиеТвердоеМасса Растворирастворавеществонавескитель1М растворNaOH2гВодагидроксида натрия5%-ый раствордиэтилдитиокарбамата0,2 М р-рДДТК342,5 мгнатрия в 0,2 МNaOHгидроксиде натрия1 М раствор формиата630 мгВодаHCOONH4аммония1 М раствор ацетатаВодаH3СCOONH4 770,8 мгаммонияОбъемрастворителя25 мл5 мл10 мл10 млII.5.
Характеристика анализируемого объектаОпределение всех аналитов осуществляли в плазме крови человека,содержащей K2ЭДТА в качестве антикоагулянта (антикоагулянт – вещество,предохраняющееиспользованиякровьвотсвертываемостианалитическихцелях).иувеличивающееПлазмуполучалисрокеепутемцентрифугирования цельной крови человека и последующего отбора плазмы впробирки Эппендорфа.69II.6. Пробоподготовка плазмы крови к анализуII.6.1. Пробоподготовка плазмы крови при определении цисплатинаК 500 мкл плазмы крови либо градуировочного раствора добавляли 500 мкл5%-го раствора диэтилдитиокарбамата натрия в 0,2 М растворе NaOH ивыдерживали при 45ºС в течение 50 мин.
Реакционную смесь, разбавленную в 2раза(объемн.)концентрированияводой,спропускаличерезпатронгидрофильно-липофильнымдлясорбентомсорбционногоOasisHLB,предварительно кондиционированным 1 мл метанола и 1 мл воды; затемпромывали сорбент 1 мл воды и 1 мл смеси вода-метанол (50:50, объемн.) иэлюировали образующийся комплекс [Pt(DDTC)3]+ 500 мкл 2%-ного растворауксусной кислоты в ацетонитриле. Элюат выпаривали в токе азота при 30ºС, исухой остаток растворяли в 500 мкл ацетонитрила.II.6.2. Пробоподготовка плазмы крови при определении силденафилаК 500 мкл плазмы крови, градуировочного раствора либо раствора QCдобавляли 5 мкл водного раствора внутреннего стандарта (10 мкг/мл), доводилиpH раствора образца до 9.0 с помощью раствора NaOH и перемешивали в шейкеревтечение10минпри2000об/мин.Затемпроводилисорбционноеконцентрирование на гидрофобном сорбенте Sep-Pak®Vac tC18.
Для этого впредварительно кондиционированный 1 мл метанола и 1 мл воды сорбционныйпатрон загружали подготовленный образец, промывали последовательно водой и30%-ным (объемн.) раствором метанола, элюировали аналиты 1 мл метанола.Полученный элюат выпаривали при 30ºС в токе азота, сухой остатокрастворяли в 500 мкл 50%-ного водного раствора ацетонитрила для дальнейшегохромато-масс-спектрометрического определения.70II.6.3.
Пробоподготовка плазмы крови при определении циклосеринаК 500 мкл плазмы крови, градуировочного раствора либо раствора QCдобавляли 10 мкл водного раствора ниацина (50 мкг/мл), 500 мкл 100 мМформиатно-аммонийного буфера (рН 2,8) и 20 мкл концентрированноймуравьиной кислоты, после чего перемешивали в шейкере 5 мин. Затем образцыцентрифугировали 2 мин при скорости 10000 об/мин и температуре 4ºС ипроводили процедуру сорбционного концентрирования на катионообменномсорбенте Oasis MCX.Для проведения ТФЭ на кондиционированный 1 мл метанола и 1 мл100 мМ формиатно-аммонийногобуфера(рН2,8)сорбентзагружалиподготовленные пробы, после чего осуществляли промывку сорбента 1 мл воды и1 мл 0,07 мМ раствора соляной кислоты в метаноле.Элюировали аналиты 1 мл 5%-ого (объемн.) раствора гидроксида аммония вметаноле.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
